Neue Methode ermöglicht schnelle Kristallstrukturanalyse intrinsisch ungeordneter Proteine

Intrinsisch ungeordnete Proteine ​​(IDPs) können ihre Konformationen je nach Umgebung dynamisch ändern und sich daher an verschiedene Verbindungen binden. Allerdings sind sie schwer zu analysieren. Forscher der Tokyo Tech haben dieses Problem nun mit einer neuartigen Pipeline gelöst, die eine schnelle Kristallstrukturanalyse von IDPs über eine zellfreie Proteinkristallisationstechnik ermöglicht.

Viele Menschen stellen sich Proteine ​​als eine Art starre „molekulare Maschinerie“ vor, bei der jedes Protein eine genau definierte Struktur hat, die seine Funktionen ermöglicht oder ergänzt. Vielen wichtigen Proteinen fehlt jedoch eine solche feste dreidimensionale Struktur. Stattdessen können diese sogenannten intrinsisch ungeordneten Proteine ​​(IDPs) je nach ihrer äußeren Umgebung eine breite Palette unterschiedlicher Konformationen annehmen. Diese inhärente Flexibilität der IDPs macht sie vielseitig und im Allgemeinen in der Lage, an viele verschiedene Verbindungen zu binden.

Im Vergleich zu anderen Proteinarten können IDPs recht schwierig zu analysieren sein. Um die biologischen Funktionen eines IDPs zu verstehen, ist es nützlich, die Faktoren – oder Determinanten – zu identifizieren, die seine Unterbereiche auf atomarer Ebene stabilisieren können. Ein bekannter Ansatz, um dies zu erreichen, besteht darin, ein Ziel-IDP zu immobilisieren, indem es an ein Proteinkristallgerüst bindet, was den Einsatz proteinkristallographischer Techniken ermöglicht. Die derzeit verfügbaren Methoden hierfür sind jedoch recht langsam und umständlich in der Anwendung.

Vor diesem Hintergrund hat sich ein Forscherteam unter der Leitung von Professor Takafumi Ueno von der School of Life Science and Technology und der International Research Frontiers Initiative (IRFI), beide am Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech), Japan, zum Ziel gesetzt, eine zuverlässigere und vielseitigere Methode zu entwickeln. In ihrer neuesten Studie veröffentlicht im Verfahren der Nationalen Akademie der Wissenschaftenberichten sie über die Entwicklung einer innovativen Pipeline zur schnellen Kristallstrukturanalyse von IDPs.

Einer der Höhepunkte dieser Pipeline ist die Verwendung einer Methode der zellfreien Proteinkristallisation (CFPC), um ein gewünschtes IDP an einen Gerüstkristall zu binden. Um die Verwendung der Pipeline zu veranschaulichen, konzentrierten die Forscher ihre Bemühungen auf ein Fragment von c-Myc, einem IDP aus einer Familie von Genen, die den Zellzyklusverlauf, die Apoptose und andere Zellfunktionen regulieren.

Mithilfe von Foldit, einer Software zur Vorhersage von Proteinstrukturen, entwarf das Team einen aus Insektenzellen gewonnenen Polyederkristall (PhC) als Gerüst, an das die c-Myc-Fragmente binden würden. Um die Kreuzkristallisation zwischen PhCs und c-Myc-Fragmenten zu beschleunigen, bereiteten die Forscher c-Myc-fusionierte PhC-Monomer-mRNA vor und mischten sie in ein System, das Zellextrakte und die Bausteine ​​von PhC enthielt.

Da die Zellextrakte die notwendige zelluläre Maschinerie zur Transkription von mRNA enthalten, kann dieses System große Mengen an c-Myc-fusionierten PhCs produzieren, ohne auf lebende Zellen angewiesen zu sein, was die Stabilisierung des IDP erheblich beschleunigt und seine anschließende Extraktion für die Analyse vereinfacht.

Nachdem die kristallisierten c-Myc-Fragmente analysiert waren, verwendeten die Forscher eine molekulardynamische Simulation, um gezielt Mutationen in das c-Myc-Gen einzuführen, bevor sie die oben genannten Schritte wiederholten. Durch den Vergleich der Bindung der modifizierten Fragmente an das PhC-Gerüst und der sich bildenden Strukturen konnte das Team die Schlüsselreste bestimmen, die letztlich die Stabilisierung von c-Myc steuerten.

„Diese Erkenntnisse unterstreichen die Leistungsfähigkeit unserer CFPC-Screening-Methode als wertvolles Instrument zur Bestimmung der Strukturen anspruchsvoller Zielproteine ​​und zur Aufklärung der wesentlichen molekularen Wechselwirkungen, die ihre Stabilität bestimmen“, sagt Ueno.

Die vorgeschlagene Strategie könnte bei der Untersuchung der biomolekularen Bindung, einem grundlegenden Aspekt in Bereichen wie der Medizin und Zellbiologie, von großem Nutzen sein.

„Unser Screening-System wird eingesetzt, um IDPs zu identifizieren, deren Bindungspartner noch nicht identifiziert wurden, und um neue Bindungsmoleküle wie Inhibitoren zu entwickeln“, sagt Ueno. „Darüber hinaus könnte uns das schnelle Screening von Kristallstrukturen ermöglichen, eine Designbibliothek von Proteinkristallen aufzubauen und so die Aufklärung der IDP-Faltungsmechanismen zu beschleunigen.“