Neue Methode ermöglicht gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung vieler Proteine

Die genaue Beobachtung von Proteinen innerhalb von Zellen ist für viele Forschungszweige äußerst wichtig, stellt jedoch eine erhebliche technische Herausforderung dar – insbesondere in lebenden Zellen, da die erforderliche Fluoreszenzmarkierung an jedem Protein einzeln angebracht werden musste.

Die Forschungsgruppe um Stefan Kubicek am CeMM hat diese Hürde nun überwunden: Mit einer Methode namens „vpCells“ ist es möglich, viele Proteine ​​gleichzeitig mit fünf verschiedenen Fluoreszenzfarben zu markieren. Dieser automatisierte Hochdurchsatzansatz, unterstützt durch KI-gestützte Bilderkennung, eröffnet völlig neue Anwendungen in verschiedenen Disziplinen, von der grundlegenden Zellbiologie bis zur Arzneimittelentwicklung. Die Studie wurde in der Fachzeitschrift veröffentlicht Naturzellbiologie.

Ohne Proteine ​​wäre das Leben, wie wir es kennen, undenkbar. Sie bilden den strukturellen Rahmen für Zellen, fungieren als Enzyme zur Steuerung des Stoffwechsels und ermöglichen Zellen die Kommunikation mit ihrer Umgebung als Membranrezeptoren, Transporter oder Signalmoleküle. All diese Funktionen können nur dann erfüllt werden, wenn sich die Proteine ​​an der richtigen Stelle innerhalb der Zelle befinden. Oft ändern sich sogar die Eigenschaften eines Proteins, wenn es seinen Standort ändert – die Kontrolle über seine Lokalisierung in der Zelle bedeutet daher auch die Kontrolle über seine Funktion.

Um die Funktion von Proteinen zu verstehen und zu erforschen, ist es wichtig, ihren Standort innerhalb der Zelle genau zu bestimmen und zu verfolgen. Proteine ​​pendeln oft dynamisch zwischen verschiedenen Organellen und Kompartimenten der Zelle. Um sie unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, werden sie oft mit einer fluoreszierenden, hell leuchtenden Proteinkomponente verknüpft. Diese Methode war jedoch mit technischen Schwierigkeiten verbunden: Typischerweise konnte die fluoreszierende Komponente jeweils nur an ein Protein gebunden werden, und um mehrere Proteine ​​zu markieren, mussten Zellen normalerweise abgetötet und fixiert werden.

Die von der Gruppe um Stefan Kubicek vorgestellte neue Methode namens „Visual Proteomics Cells“ (abgekürzt vpCells) ermöglicht es, Proteine ​​so fluoreszierend zu markieren, dass ihre körpereigenen Regulationsmechanismen erhalten bleiben. Anstatt jeweils ein Protein zu markieren, können vpCells in einem sogenannten Multiplex-Ansatz viele Proteine ​​gleichzeitig mit einem fluoreszierenden Tag fusionieren.

Ein Vorläufer dieser Methode wurde bereits 2020 von Kubiceks Team zur Untersuchung von Stoffwechselenzymen beschrieben. Nun wurde es in dreifacher Hinsicht erweitert und verbessert:

Erstens kann vpCells mithilfe des CRISPR/Cas9-Geneditierungstools alle theoretisch möglichen Proteine ​​markieren, um fluoreszierende Proteine ​​genetisch an die untersuchten Proteine ​​anzubinden. Kubiceks Gruppe hat zu diesem Zweck eine genomweite „Bibliothek“ geschaffen, die die Fluoreszenzmarkierung und systematische funktionelle Erforschung aller möglichen menschlichen Proteine ​​ermöglicht.

Zweitens nutzen vpCells nicht nur eine Fluoreszenzfarbe, sondern insgesamt fünf Komplementärfarben. In jeder Zelle werden zwei verschiedene zu verfolgende Proteine ​​markiert. Zusätzlich wird eine weitere Farbmarkierung verwendet, um einzelne Klone besser unterscheiden zu können. Und zwei weitere Farben markieren Zellkern und Membran, um einzelne Zellen besser abgrenzen zu können.

Drittens ermöglicht dieses Farbschema nicht nur die Erzeugung optisch ansprechender Bilder, sondern auch die optische Erkennung und Unterscheidung der verschiedenen Proteine. Normalerweise erfordert dies eine komplexe DNA-Sequenzierung nach der Bildgebung, um zu bestimmen, welches Protein markiert ist. Der vpCells-Ansatz hingegen ermöglicht es, ein KI-gestütztes Bilderkennungssystem darauf zu trainieren, allein anhand von Fluoreszenzmikroskopiebildern zu erkennen, welches Protein in welcher Zelle markiert ist.

In zwei Anwendungen hat die Methode bereits ihren Nutzen bewiesen: Zum einen wurden mehr als 4.500 Zelllinien als Reporter für mehr als 1.100 Proteine ​​generiert. Diese Zelllinien wurden verwendet, um die KI-Modelle zu trainieren und die Lokalisierung der Proteine ​​in ihrem Grundzustand zu beschreiben. Alle Bilder der einzelnen markierten Proteine ​​sind in der öffentlich zugänglichen Webdatenbank verfügbar vpCells.

Andererseits wurden die lebenden Reporterzellen für eine konkrete Forschungsfrage genutzt: Kubiceks Team untersuchte die Wirkung von mehr als 1000 niedermolekularen Substanzen auf 61 für Krebszellen relevante Proteine. Die Forscher fanden heraus, dass 44 der getesteten Substanzen die Menge oder Lokalisierung einzelner Proteine ​​innerhalb von 6 Stunden veränderten. Bei einem der Stoffe handelte es sich um einen Hemmer des Proteintransports aus dem Zellkern, der eine ähnliche Wirkung hat wie ein klinisch zugelassenes Medikament gegen das Multiple Myelom, eine Krebserkrankung des blutbildenden Systems.

„Diese Ergebnisse geben einen ersten Einblick in die Vielseitigkeit der vpCells-Methode“, sagt Kubicek. „Wir erwarten für die Zukunft noch viele weitere Anwendungen, von der grundlegenden Zellbiologie bis zur angewandten Arzneimittelforschung.“