Neue Forschungsergebnisse beginnen, das Regelwerk zur effektiven Nutzung der CRISPR-Aktivierungstechnologie zu schreiben.
Forscher des Wellcome Sanger Institute und Mitarbeiter haben menschliche Stammzellen und Neuronen verwendet, um die Merkmale zu untersuchen, die beeinflussen, wie gut die CRISPR-Aktivierung für verschiedene Gengruppen funktioniert.
Veröffentlicht heute (13. März 2023) in Molekulare Zelleerläutert die Studie die Regeln, inwieweit Gene auf die CRISPR-Aktivierung reagieren, um sicherzustellen, dass zukünftige Forschung so effizient wie möglich gestaltet werden kann.
Die CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) ist eine Art der CRISPR-Geneditierung, die verwendet wird, um bestimmte Gene zu überexprimieren. Obwohl diese Technik weit verbreitet ist, kann es schwierig sein, ihre Effizienz vorherzusagen, wenn sie auf bestimmte Punkte im Genom abzielt, was es schwierig macht, bestimmte Gene zuverlässig zu überexprimieren.
Diese neue Studie integrierte ein Markergen an Tausenden von Punkten in das Genom einer menschlichen Stammzelllinie, die dann mit CRISPRa aktiviert wurde, um zu sehen, wo dies erfolgreich war. Die verwendete Stammzelllinie differenziert sich in Neuronen, was es dem Team ermöglicht, auch Informationen über die CRISPRa-Effizienz in verschiedenen Zelltypen zu sammeln.
Das Team deckte mehrere Merkmale auf, die sich auf die CRISPRa-Effizienz auswirken, darunter Expressionsniveau, Chromatinstatus, Zellzustand und Genort. Sie fanden heraus, dass bivalente Gene, die Schlüsselgene der Entwicklungsregulatoren sind, die sowohl unterdrückende als auch aktivierende Markierungen in derselben Region haben, durch CRISPRa robust aktiviert werden können. Sie entdeckten auch, dass CRISPRa die gleichen Überexpressionsniveaus erreichen könnte, die notwendig sind, um signifikante Veränderungen des Zellzustands voranzutreiben und sie zur Differenzierung zu veranlassen.
Das Team fand heraus, dass zwar die meisten Gene durch CRISPRa aktiviert werden können, aber nicht jede Zelle in gleichem Maße reagiert. Beispielsweise zeigten Gene, die H3K9me3-unterdrückende Regulatoren enthalten und daher vor einer Aktivierung abgeschirmt sind, eine größere Variation in der Reaktion.
Diese Daten zeigen zum ersten Mal, dass CRISPRa allgemein über Chromatinzustände und Zelltypen hinweg anwendbar ist, und heben die Faktoren hervor, die den Grad der Genaktivierung beeinflussen, und wie einfach es ist, die Effekte zu reproduzieren. Das Verständnis dieser Faktoren ist wichtig für das Design und die Analyse von CRISPRa-Screens, die verwendet werden, um nach Genen zu suchen, die an genetischen Krankheiten beteiligt sind.
Weitere Forschung ist erforderlich, um diese Regeln weiter zu ergänzen und zu sehen, ob sich verschiedene CRISPRa- oder CRISPR-Interferenztechniken ähnlich verhalten.
Dr. Qianxin Wu, Erstautor vom Wellcome Sanger Institute, bemerkte: „Unsere Forschung hat ein System zur Berichterstattung über die Wirksamkeit der CRISPR-Aktivierung in Stammzellen etabliert, das es uns ermöglicht, ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie CRISPRa in mehreren Zellzuständen funktioniert. Wir zeigten auch, dass die CRISPR-Genaktivierung stark genug ist, um Stammzellen dazu zu bringen, sich in andere Zellzustände zu differenzieren.Dies deutet darauf hin, dass CRISPRa-Screens verwendet werden können, um nach Genen zu suchen, die an zellulären Prozessen beteiligt sind, oder um genauere Modelle von Zelltypen im Körper zu erstellen, die helfen Erforschung genetischer Krankheiten und regenerativer Medizin.“
Dr. Andrew Bassett, leitender Autor vom Wellcome Sanger Institute, bemerkte: „Die CRISPR-Aktivierung ist eine weit verbreitete und unglaublich wertvolle Technik, wenn es um die Genombearbeitung geht, und unsere Forschung zielt darauf ab, diejenigen zu unterstützen, die sie anwenden, und ihnen zu helfen, das Beste daraus zu machen ihrer Experimente. Durch die systematische Untersuchung der Faktoren, die sich auf die CRISPRa-Effizienz auswirken, haben wir eine Reihe von Regeln erstellt, die zeigen, wo es am effektivsten oder am wenigsten effektiv ist, und unser Verständnis der beteiligten Faktoren vertieft.“
Mehr Informationen:
Qianxin Wu et al, Massiv parallele Charakterisierung der Wirksamkeit von CRISPR-Aktivatoren in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und Neuronen, Molekulare Zelle (2023). DOI: 10.1016/j.molcel.2023.02.011