Neuartiges Hydrogel findet innerhalb weniger Tage neue Aptamere oder „chemische Antikörper“.

Ein DNA-Doppelhelix-Strang könnte 1,80 m lang sein, ist aber so eng gewunden, dass er eine ganze Nukleotidsequenz in den winzigen Zellkern packt. Wenn dieselbe DNA stattdessen in zwei Stränge gespalten und in viele, viele kurze Stücke geteilt würde, würden daraus Billionen einzigartig gefalteter 3D-Molekülstrukturen, die in der Lage wären, sich an spezifisch geformte Moleküle zu binden und diese möglicherweise zu manipulieren – wenn sie perfekt passen.

Diese kurzen, einzelsträngigen DNA- oder RNA-Abschnitte werden Aptamere, auch „chemische Antikörper“ genannt, genannt. Den Forschern der Penn State University zufolge werden sie in der Biomedizin als nützliche therapeutische oder diagnostische Mittel eingesetzt, insbesondere als Ersatz für biologische Antikörper. Um jedoch das perfekte Aptamer für ein Zielmolekül zu finden – beispielsweise das p53-Protein, das Krebstumoren unterdrückt –, muss ein Pool potenzieller Aptamerkandidaten durchsucht werden, der die Anzahl der Sterne in der Milchstraße übersteigt. Der Prozess kann Monate dauern und führt häufig dazu, dass überhaupt keine Übereinstimmung vorliegt.

Eine neue von Forschern der Penn State entwickelte Methode nutzt ein Hydrogel – ein Polymernetzwerk, das seine Form beibehält und sich ausdehnen kann, wenn es eine große Menge Wasser aufnimmt –, um „hochaffine“ oder gut passende Aptamere beizubehalten, während der Rest die Aptamer-Kandidaten verlassen das Gel nach 60 Stunden. Das Team berichtete über seine „Hydrogel for Aptamer Selection“ (HAS)-Methode und Ergebnisse in Naturbiotechnologie.

Die HAS-Methode könnte die Hürde für Forscher senken, die das Potenzial von Aptameren – die einfacher zu modifizieren sind, eine längere Haltbarkeit haben und einen einfacheren Gewebezugang als Antikörper ermöglichen – in einer Reihe biomedizinischer Anwendungen wie der regenerativen Medizin und Arzneimitteln erforschen möchten Lieferung, Zelltechnik, Bioimaging und mehr, so der korrespondierende Autor Yong Wang, Professor für Biomedizintechnik an der Penn State.

„Die Suche nach Aptameren ist nicht nur für Anfänger, sondern auch für erfahrene Forscher frustrierend – wie die Suche nach einer Nadel im Heuhaufen“, sagte Wang.

„Viele Forscher sind daran interessiert, Aptamere für ihre Projekte zu verwenden, aber da es sehr schwierig ist, sie zu bekommen, können sie ihre Ideen nicht testen oder neue Anwendungen erforschen. Aptamere können allein als Therapeutika verwendet werden, sie können mit Medikamenten oder Nanopartikeln konjugiert werden.“ Während sie die Abgabe steuern und die Wirksamkeit verbessern, können sie zur Funktionalisierung eines Nachweiskits zur Untersuchung, ob eine Blutprobe Viren oder Krebsbiomarker enthält, eingesetzt werden. Grundsätzlich können Aptamere überall dort eingesetzt werden, wo Antikörper entwickelt werden.“

Das Hydrogel des Teams – hergestellt aus Polyethylenglykol (PEG) – enthielt immobilisierte Zielmoleküle des Proteins Thrombin, das die Gerinnung im Blutkreislauf erleichtert. Sobald eine Aptamer-Bibliothek in das Hydrogel injiziert wurde, banden hochaffine Kandidaten an die sich nicht bewegenden Ziele, während die weniger gut passenden Aptamere frei durch die Poren diffundierten, ähnlich wie Ornamente ohne Haken durch einen Weihnachtsbaum fallen würden, ohne dass es etwas zum Auffangen gibt weiter zu den Filialen.

Dieser Diffusionsansatz unterscheidet sich von herkömmlichen Methoden, bei denen Zielmoleküle und die Aptamerbibliothek in einer Lösung gemischt und dann durch eine dünne Membran filtriert werden. Der Filtrationsschritt werde viele Male wiederholt und gute Aptamer-Kandidaten gehen dabei oft verloren, so Wang.

„Leider handelt es sich bei der molekularen Bindung um eine physikalische Wechselwirkung, und während des Filtrationsschritts können sich bestimmte Kandidaten von den Zielmolekülen lösen, durch die Membran dringen und verloren gehen“, sagte Wang. „Bei unserer Methode bindet ein gewünschter Aptamerkandidat erneut an ein immobilisiertes Molekül, wenn es von einem zuvor gebundenen Zielmolekül abfällt. Daher geht der Kandidat während des Diffusionsvorgangs nicht so leicht verloren.“

Die Forscher stellten das poröse Hydrogel her, indem sie eine mit Acrylsäure vermischte Vorgelierungslösung einfrierten, die später chemisch mit Carboxylgruppen im Polymer reagierte und die eingebetteten Thrombinproteine ​​bildete, die so immobilisiert waren, dass sie das Hydrogel nicht verließen.

Während dieses „Kryogelierungsprozesses“ traten auch Eiskristalle auf, die über das gesamte PEG-Polymernetzwerk verteilt waren und schließlich schmolzen und die Poren des Hydrogels bildeten, als es auf Raumtemperatur gebracht wurde. PEG sei „nicht verschmutzend“, sagte Wang, was bedeutet, dass das Material im Gegensatz zu den Wechselwirkungen der Aptamere mit den Membranen die unerwünschte Bindung von Aptameren an das Hydrogel einschränkt.

Die HAS-Methode macht auch die Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (PCR) überflüssig, ein Schritt bei herkömmlichen Methoden, bei denen jede Runde eine neue Aptamerbibliothek synthetisch auf der Grundlage der verbleibenden Aptamere in der vorherigen Membran generiert wird.

„Die Amplifikation basiert auf PCR, die darauf abzielt, einige Kandidaten zu amplifizieren, anstatt alle Kandidaten gleich zu behandeln“, sagte Wang. „Forscher haben herausgefunden, dass diese Voreingenommenheit jedes Mal schwerwiegender werden kann, wenn sie wiederholt wird, und dass sie möglicherweise nicht finden, was sie wollen, nachdem sie viel Zeit, Arbeit und Geld investiert haben.“

Als Basistest entwickelten die Forscher ein PEG-Hydrogel ohne eingebettetes Thrombin und führten die Aptamer-Bibliothek ein. Dabei stellten sie fest, dass nach 60 Stunden kaum noch Aptamere im Gel vorhanden waren. Dies deutete darauf hin, dass das „Hintergrundrauschen“ der unspezifischen Bindung – Aptamer an Hydrogel – verschwunden war, und es wurde zum Zeitlimit, das die Forscher in ihrem Testprozess verwendeten.

Die Aptamer-Kandidaten im Thrombin-immobilisierten Hydrogel wurden gesammelt und mit Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation analysiert. Die Forscher priorisierten 50 Aptamer-Kandidaten, kategorisierten sie weiter und testeten ihre Bindungseffizienz. Es wurde festgestellt, dass das aus dem Pool identifizierte „Anti-Thrombin-Aptamer“ eine Bindungsaffinität aufweist, die mit der Bindungsaffinität vergleichbar ist, die über 10 Zyklen der Aptamer-Selektion mit herkömmlichen Methoden identifiziert wurde.

„Die Aptamerauswahl kann in einem einzigen Schritt erreicht werden, ohne dass ein wiederholter Prozess erforderlich ist, und alle Bedenken hinsichtlich wiederholter Vorgänge werden vermieden“, sagte Wang und fügte hinzu, dass weitere Arbeiten an der HAS-Methode diesen Ansatz verfeinern werden, einschließlich der Auswahl von Aptameren Nicht-Protein-Zielmoleküle oder sogar lebende Zellen, wenn sie unter Umgebungsbedingungen im Hydrogel gehalten werden können. „Wir hoffen, dass HAS Forschern dabei helfen wird, verschiedene Bereiche zu erforschen, die molekulare Bindung oder Erkennung erfordern.“

Zu den Mitarbeitern dieser Studie gehörten auch der Co-Erstautor Naveen Singh, früher Postdoktorand am Penn State Department of Biomedical Engineering, jetzt am Indian Institute of Technology Delhi; sowie die Co-Erstautoren Yixun Wang, Connie Wen, Brandon Davis, Xuelin Wang und Kyungsene Lee, alles Doktoranden der biomedizinischen Technik der Penn State.