Biosensoren – Sensoren, die biologische Proben erkennen können – sind leistungsstarke Werkzeuge zum Verständnis der Funktion, Zusammensetzung und Struktur biochemischer Moleküle. Biosensoren werden häufig zum Nachweis von Proteinen und ihren Untereinheiten, den so genannten Peptiden, eingesetzt, wodurch sich ein breites Spektrum an biomedizinischen Anwendungen ergibt.
Im Jahr 2017 entwickelten Forscher der Columbia University in den USA einen lebenden Hefe-Biosensor, indem sie Pheromon-bezogene Signalwege neu verdrahteten, die von Hefe für die Paarung verwendet werden. In Gegenwart des Pheromonpeptids könnte der G-Protein-gekoppelte Rezeptor (GPCR) das Peptid erkennen und eine Kaskade auslösen, die schließlich ein Pigment namens Lycopin aktiviert, das Tomaten ihre rote Farbe verleiht.
Somit könnte der Hefe-Biosensor durch eine einfache Farbänderung, die mit bloßem Auge sichtbar ist, das Vorhandensein eines bestimmten Peptids signalisieren. Diesem System fehlte jedoch ein peptidspaltendes katalytisches Enzym namens Protease, dessen Zugabe seine Biosensor- und Unterscheidungsfähigkeiten verbessern sollte.
Dementsprechend geht aus einer kürzlich veröffentlichten Studie hervor BioDesign-Forschungentwickelte die Gruppe eine neue und verbesserte duale Version ihres Biosensors für lebende Hefen, indem sie co-exprimierte Hefeproteasen einbezog.
Die Hauptforscherin dieser Studie, Prof. Virginia W. Cornish, erklärt: „Unser Ziel war es, einen dualen Biosensor zu entwickeln. Im ersten Teil würde der Biosensor ohne die Protease das Vorhandensein aller Peptidvarianten nachweisen. Im zweiten Teil, die Protease vorhanden wäre. Nur eine Variante des Proteins würde von der Protease gespalten, so dass eine Farbänderung nur für diese spezifische Variante sichtbar wäre. Hier haben wir versucht, einen Proof-of-Concept für dieses Sensormodell zu entwickeln.“
Die Entwicklung dieses hochmodernen Biosensors war ein langer und technisch anspruchsvoller Prozess. Die Forscher behielten ihr ursprüngliches Modell bei, nutzten die Paarungswege in Hefen und untersuchten die Dosis-Wirkungs-Kurven von fünf Pilzpheromon-GPCRs, Peptiden und Proteasen aus Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus und Schizosaccharomyces japonicus. Von diesen lieferten die ersten beiden die selektivsten Antworten.
Anschließend analysierten sie die Peptide dieser beiden Arten, dh S. cerevisiae und C. albicans, mithilfe von Alanin-Scanning – einer Technik, die aufzeigt, wie bestimmte Teile eines Peptids zu seiner Stabilität und Funktion beitragen. Alanin-Scanning wurde mit und ohne Protease durchgeführt.
Dementsprechend wurden zwei Peptidvarianten identifiziert, die von der Protease nicht effizient gespalten werden konnten: CaPep2A und CaPep2A13A. In der Zwischenzeit konnten ihre Schwesterpeptide – CaPep bzw. CaPep13A – effizient gespalten werden. Darüber hinaus konnten die Farbänderungen mit bloßem Auge beobachtet werden, ohne dass eine Spezialausrüstung erforderlich war.
Diese Komponenten wurden in einer lebenden Hefezelle kombiniert, um den Zweiphasen-Biosensor zu entwickeln. Proof-of-Concept-Experimente zeigten, dass der Biosensor nicht nur das Vorhandensein von CaPep/CaPep2A und CaPep13A/CaPep2A13A erkennen, sondern auch zwischen ihnen unterscheiden konnte. Somit verbesserte die Wiedereinführung der Protease erwartungsgemäß die Fähigkeiten und potentiellen Anwendungen des ursprünglichen Biosensors in großem Ausmaß.
Laut Prof. Cornish und ihrem Team ist diese Arbeit der erste grundlegende Schritt zur Entwicklung eines Biosensors, der zwischen einer Vielzahl von Peptiden unterscheiden kann. „Synthetische Biologie ist ein schrittweiser Prozess. Der in der aktuellen Studie entwickelte Rahmen kann durch zusätzliches Engineering mittels Computermodellierung und gerichteter Evolution verbessert werden. Dies wird den Umfang der Erkennungsfähigkeiten von Biosensoren erweitern“, kommentiert sie.
„Wir könnten diese proteasehaltigen Biosensoren in Point-of-Care-Diagnosewerkzeugen und Medikamententests verwenden und sogar eine skalierbare Kommunikationssprache entwickeln. Die Möglichkeiten sind endlos“, beschreibt sie abschließend ihre Vision für die Zukunft.
Insgesamt liefert diese Studie wichtige Einblicke in die Manipulation von Hefe-Paarungskomponenten für die Entwicklung von Werkzeugen der synthetischen Biologie. Die Ergebnisse sind ein Beweis für die aufregenden Entwicklungen auf dem Gebiet der Biotechnik und ihr Potenzial, unsere Zukunft zu verändern.
Mehr Informationen:
Tea Crnković et al, Peptidvariantenerkennung durch einen lebenden Hefe-Biosensor über eine Epitop-selektive Protease, BioDesign-Forschung (2023). DOI: 10.34133/bdr.0003