Neuartige Methode zur Massenproduktion rekombinanter Proteine ​​nutzt Mononatriumglutamat

Die Massenproduktion rekombinanter Proteine ​​in Hefezellfabriken erfordert Methanol, eine Verbindung, die sicher gehandhabt werden muss, Brandgefahr birgt und manchmal schädliche Nebenprodukte erzeugt. Forscher am Department of Biochemistry (BC) des Indian Institute of Science (IISc) haben nun ein alternatives, sichereres Verfahren entwickelt, das stattdessen auf einem gängigen Lebensmittelzusatzstoff namens Mononatriumglutamat (MSG) basiert.

Rekombinante Proteine ​​wie Impfstoffantigene, Insulin und monoklonale Antikörper werden in großen Mengen produziert, indem modifizierte Bakterien-, Virus- oder Säugetierzellen in großen Bioreaktoren gezüchtet werden. Der am häufigsten verwendete Organismus ist die Hefe Pichia pastoris (jetzt Komagataella phaffii). Sie enthält einen einzigartigen Promotor – eine spezifische Genregion, die durch Methanol aktiviert werden kann. Dieser Promotor kodiert für ein Enzym namens Alkoholoxidase (AOX).

Um ein rekombinantes Protein in Massen zu produzieren, wird das Gen, das für dieses Protein kodiert, direkt neben dem AOX-Promotor in das Hefegenom eingefügt. Die Hefezellen werden dann mit Glycerin oder Glukose als Kohlenstoffquelle gefüttert. Sobald sich genügend Zellen gebildet haben, wird Methanol hinzugefügt, das den AOX-Promotor aktiviert, und die Zellen beginnen, das rekombinante Protein in großen Mengen zu produzieren.

Die meisten Industrien nutzen diesen Methanol-induzierten Prozess zur Herstellung rekombinanter Proteine. Methanol ist jedoch leicht entflammbar und gefährlich und erfordert strenge Sicherheitsvorkehrungen, betont PN Rangarajan, Professor an der BC und korrespondierender Autor der Studie, die in Mikrobielle Zellfabriken. Beim Stoffwechsel von Methanol entsteht außerdem Wasserstoffperoxid, das in den Hefezellen oxidativen Stress auslösen oder die rekombinanten Proteine ​​schädigen kann.

Um dieses Problem zu lösen, begann Trishna Dey, eine ehemalige Doktorandin am BC, nach Alternativen zu suchen. Nach einer umfangreichen Suche fand das Team heraus, dass Mononatriumglutamat (MSG), ein von der USFDA zugelassener Lebensmittelzusatzstoff, einen anderen Promotor im Hefegenom aktivieren kann, der für ein Enzym namens Phosphoenolpyruvatcarboxykinase (PEPCK) kodiert. Die Aktivierung dieses Promotors mit MSG führte zu einer Proteinproduktion, die der Methanolaktivierung des AOX-Promotors ähnelte.

Die Optimierung des Zellkulturmediums für diesen neuen und ungetesteten Prozess war eine Herausforderung, sagt Neetu Rajak, Erstautorin und Doktorandin am BC. Lange Zeit wuchsen die Hefezellen in Schüttelkolben schlecht und produzierten nur sehr wenig rekombinantes Protein. „Es gab eine Zeit, in der wir fast aufgegeben hätten, weil wir dachten, es würde nicht funktionieren“, erinnert sich Rangarajan.

Die Gruppe erkannte schließlich, dass MSG allein nicht ausreichte. Vedanth Bellad und Yash Sharma, Projektassistenten bei BC und Co-Autoren, erklären, dass sie versuchten, die Kultur mit verschiedenen anderen Verbindungen zu ergänzen, bis eine schließlich den gewünschten Erfolg brachte: Ethanol.

Durch Zugabe von Ethanol konnten die Zellen schneller wachsen, was die Biomasse und die Menge des produzierten rekombinanten Proteins erhöhte. Ethanol ist für Hefezellen im Vergleich zu Methanol zudem sicherer, da es beim Abbau keine giftigen Nebenprodukte erzeugt.

Um ihr Verfahren zu testen, versuchte das Team, die Rezeptorbindungsdomäne von SARS-CoV-2 zu produzieren – ein weit verbreitetes Impfstoffantigen, das erfolgreich in Hefe- und Säugetierzellen exprimiert wurde. Sie stellten fest, dass ihr neues Expressionssystem im Vergleich zum Methanol-induzierten Verfahren die doppelte Menge an Antigen produzierte.

Die Forscher hoffen, dass dieses neuartige und einheimische Expressionssystem in der Biotechnologiebranche zur Massenproduktion wertvoller Proteine, darunter Milch- und Eiproteine, Babynahrungsergänzungsmittel und Nutraceutika, sowie therapeutischer Moleküle eingesetzt werden kann.