Neuartige Methode deckt energieabhängige Strahlenschäden an gefrästen Lamellen durch fokussierten Ionenstrahl auf

Verglichen mit dem gereinigten Protein in vitro weisen intrazelluläre biologische Makromoleküle eine vollständigere und physiologischere Konformation auf. Daher ist die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur von Proteinen direkt in vivo das nächste Ziel der Strukturbiologie und auch die Grenze der Entwicklung der Kryo-Elektronenmikroskopie-Technologie (Kryo-EM).

Zellen müssen in Lamellen von ca. 150 nm verdünnt werden, um die Dickenanforderungen der Kryo-EM-Bildgebung zu erfüllen, und ein fokussierter Ionenstrahl (FIB) wird verwendet, um die qualifizierten Lamellen zu erzeugen, indem die gefrorene Zelle mit hochenergetischen Ionenstrahlen gemahlen wird. Allerdings beschädigt FIB die Lamellen beim Fräsen sowohl an der Ober- als auch an der Unterseite, und eine quantitative experimentelle Analyse des Schadens muss noch durchgeführt werden und es ist unbekannt, wie der Schaden reduziert werden kann.

In einer Studie veröffentlicht in StrukturForscher vom Institut für Biophysik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften stellten eine quantitative Analysemethode für Kryo-FIB-Schäden vor und zeigten, dass das Polieren mit Niedrigenergiestrahlen für die Herstellung hochwertiger, dünnerer Lamellen unerlässlich ist.

Diese Arbeit etabliert eine neue Methode zur Quantifizierung der Schädigung von Zelllamellen durch FIB. Die Proteine ​​in den Zelllamellen werden durch die Elektronentomographie-Rekonstruktion nach dem Abstand von den Oberflächen gruppiert. Basierend auf der 3D-Rekonstruktion der Proteine ​​in jeder Gruppe berechneten die Forscher das durchschnittliche Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) des Proteins in jeder Gruppe. Die durchschnittlichen SNRs spiegelten die Datenqualität des Proteins in verschiedenen Gruppen wider und repräsentierten auch quantifiziert den Schadensgrad des FIB am Protein in verschiedenen Abständen von den Oberflächen.

Die Forschung ergab, dass FIB in einer Tiefe von 50 nm auf der Oberfläche von Lamellen nicht vernachlässigbare Schäden verursachte. Der Schaden an der Oberfläche ähnelte dem durch die Exposition gegenüber 16 e–/Å2 in einem 300-kV-Kryoelektronenmikroskop und betrug 3,5 e–/Å2 im ~50-nm-Bereich. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einer Lamellendicke von weniger als 100 nm der Schaden durch beide Oberflächen im Mittelbereich verdoppelt wird, was zu Schäden von mehr als 7 e–/Å2 vor der Belichtung führt.

Um eine höhere 3D-Rekonstruktionsauflösung zu erreichen, sollte die Dicke der Zelllamelle theoretisch so dünn wie möglich sein. FIB schädigt jedoch alle Proteine ​​in der Lamelle mit einer Dicke von weniger als 100 nm. Ein solcher Widerspruch macht es schwierig, eine 3D-Rekonstruktion mit nahezu atomarer Auflösung für die FIB-gefrästen Lamellen zu erhalten. Um die Begrenzung der Schadenstiefe auf die Mindestdicke der Lamelle zu durchbrechen, ergaben weitere Untersuchungen, dass die Dicke der Schadensschicht auf weniger als 30 nm reduziert werden kann, indem die Frässpannung des FIB auf 8 keV reduziert wird.

Die Verbesserung der Auflösung ist für die Untersuchung von Proteinen in situ von entscheidender Bedeutung, und die Gewinnung qualitativ hochwertiger Lamellen ist eine wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Auflösung der 3D-Rekonstruktion. Diese Arbeit lieferte nicht nur ein Werkzeug zur qualitativen Messung der Lamellenqualität, sondern schlug auch ein Schema zur Reduzierung von FIB-Schäden in Kryolamellen vor, was zu einer weiteren Verbesserung der Auflösung der In-situ-Strukturanalyse beiträgt.