Native Top-Down-Massenspektrometrie enthüllt die Rolle von Glykanen in Protein-Oligomeren

Viele Proteine ​​enthalten Muster von Zuckermolekülen (Glykanen) und bestehen aus mehreren aggregierten Untereinheiten. Diese Glykosylierung und Oligomerisierung hat einen entscheidenden Einfluss auf die Proteinfunktion und muss bei der biopharmazeutischen Entwicklung berücksichtigt werden.

Im Tagebuch Angewandte Chemiehat ein britisches Team einen Ansatz vorgestellt, der auf nativer Top-Down-Massenspektroskopie (MS) basiert und zur Analyse des Zusammenspiels zwischen Glykosylierung und Oligomerisierung in verschiedenen therapeutischen Hormonen und Zytokinen verwendet werden kann.

Bei der konventionellen MS zerfallen Moleküle in Fragmente, aber die native MS ermöglicht es, gefaltete Proteinoligomere, die an Glykane gebunden sind, zu untersuchen. Beim Top-Down-Verfahren werden die Oligomere anschließend mittels einer Gasphasendissoziation getrennt und vermessen. In einem letzten Schritt werden die Glykane durch Gasphasenfragmentierung abgespalten und analysiert.

Für einen gegebenen Proteinkomplex kann so bestimmt werden, welche Anteile an Monomeren und Oligomeren – ob in einem Organismus oder in einer Medikamentencharge – vorhanden sind und welche unterschiedlichen Glykosylierungsmuster in welchen Mengen auftreten.

Carol V. Robinson und Di Wu von der University of Oxford (UK) konzentrierten sich auf Glykane, die sich an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten befinden und eine wichtige Rolle bei der Oligomerisierung spielen können. Sie verglichen die Ergebnisse ihrer Messungen mit einem theoretischen Modell, das auf der Grundlage der dissoziierten Untereinheiten berechnet wurde. Dadurch konnten Rückschlüsse auf die stabilisierende Wirkung der Glykane gezogen werden.

Eines der untersuchten therapeutischen Glykoproteine ​​war Interferon-β (IFN-β), ein entzündungshemmendes Zytokin, das zur Behandlung von Erkrankungen wie Multipler Sklerose eingesetzt wird. IFN-β1a bildet ein asymmetrisches Homodimer. Die MS-Analysen zeigten, dass die meisten der primären Formen sowohl des Monomers als auch des Dimers glykosyliert sind. Für dieses Zytokin ist die Dimerisierung jedoch unabhängig vom Glykosylierungsstatus.

Anders sieht es beim Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), einem Entzündungszytokin, aus. Antikörperbasierte Biopharmazeutika, die TNF-α neutralisieren, werden bei Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn und Psoriasis eingesetzt. TNF-α ist ein Homotrimer mit einem Glykan an der Schnittstelle jeder Untereinheit. Die MS-Analysen und Experimente mit einem kleinen Molekül, das die Trimerisierung unterbricht, zeigten, dass die Glykane das TNF-α-Trimer signifikant stabilisieren.

Robinson und Wu untersuchten auch das follikelstimulierende Hormon (FSH, Follitropin), ein Heterodimer aus α- und β-Untereinheiten. Medikamente auf der Basis von Follitropin α werden für Fruchtbarkeitsbehandlungen verwendet. Das Team entdeckte eine ungewöhnliche Verteilung von Glykanen auf der α-Untereinheit. Eines dieser Glykane interagiert intensiv mit der β-Untereinheit und ist eindeutig an der Regulierung der Dimerisierung beteiligt.

Das durch native Top-down-MS-Experimente gewonnene Wissen könnte dazu beitragen, Glykane in therapeutischen Proteinen maßzuschneidern, um ihre Stabilität und Wirksamkeit zu verbessern.