Molekulare Überwachung der RNA-Regulation

Je besser wir zelluläre Prozesse wie die RNA-Regulation verstehen, desto bessere molekulare Therapien können entwickelt werden. Besonders schwierig war es bislang, die Regulation der nicht-kodierenden RNA zu verfolgen, also der RNA, die nicht weiter in Proteine ​​umgewandelt wird.

Ein Forscherteam der Technischen Universität München (TUM) und Helmholtz München hat nun ein minimal-invasives Reportersystem entwickelt, das eine hochempfindliche Überwachung der RNA-Produktion sowohl von kodierender als auch nicht-kodierender RNA ermöglicht.

Für zelluläre Prozesse wird unsere genetische DNA-Information in RNA umgeschrieben, die dann weiterverarbeitet wird, bevor sie entweder als Bauplan für Proteine ​​dient oder selbst eine zelluläre Funktion erfüllt. Welche Arten von RNA in welchen Mengen produziert werden, verrät viel über den Zustand unserer Zellen. Bei einer Infektion beispielsweise produzieren Zellen vermehrt RNA-Moleküle, die für Proteine ​​kodieren, die an der Immunantwort beteiligt sind.

Wenn DNA-Moleküle über RNA in Proteine ​​übersetzt werden, können Forscher den Prozess mit bestehenden Reportersystemen verfolgen. Allerdings codieren nicht alle menschlichen Gene Proteine. Die Mehrheit der menschlichen Gene ist nicht codierend, einschließlich der Gene für lange nicht codierende RNAs (lncRNA). Das sind RNA-Moleküle mit mehr als 200 Bausteinen, die nicht als Bauplan für Proteine ​​fungieren. Stattdessen steuern sie wichtige Prozesse in Zellen. Erste Untersuchungen zeigen, dass lncRNA unter anderem an der Regulierung der RNA-Produktion, der Organisation von Strukturen im Zellkern oder am An- und Abschalten bestimmter Enzyme beteiligt ist.

Trotz ihrer Bedeutung für zelluläre Prozesse war es schwierig, lncRNAs mit bestehenden Methoden zu untersuchen. Bisher war dies nur teilweise möglich, beispielsweise in fixierten Zellen zu bestimmten Zeitpunkten, da klassische Reportersysteme, die auf der Translation in Proteine ​​basieren, nicht verwendet werden können.

INSPECT erlaubt die Überwachung von nicht-kodierender RNA

Eine Lösung wurde nun in Form eines neuen Meldesystems gefunden: INSPECT. Ein Team um Gil Westmeyer, Professor für Neurobiological Engineering an der TUM und Direktor des Instituts für Synthetische Biomedizin bei Helmholtz München, hat nun das neu entwickelte Reportersystem in der Fachzeitschrift veröffentlicht Natur Zellbiologie.

„Im Gegensatz zu früheren Methoden codiert INSPECT Sequenzen für Reporterproteine ​​in modifizierten Introns. Dies sind Sequenzen im vorzeitigen RNA-Molekül, die auf natürliche Weise entfernt und von der Zelle während der Verarbeitung eliminiert werden. INSPECT stabilisiert die Introns, anstatt nach der Entfernung abgebaut zu werden werden sie in das zelluläre Zytoplasma transportiert, wo sie in Reporterproteine ​​übersetzt werden“, erklärt Erstautor Dong-Jiunn Jeffery Truong. Mit herkömmlichen Methoden können die Forscher dann Reporterprotein-Signale wie Fluoreszenz nachweisen.

INSPECT verändert weder die fertige RNA noch die Proteine

Das neue molekularbiologische Werkzeug löst damit nicht nur das Problem, die Entstehung nicht-kodierender RNA zu verfolgen, sondern bietet auch Vorteile für die Untersuchung kodierender RNA. Gegenwärtige Reportersysteme laufen oft Gefahr, die zu untersuchende RNA oder Proteine ​​zu schädigen, weil sie beispielsweise direkt mit der zu untersuchenden RNA fusioniert werden müssen, um in Proteine ​​co-übersetzt zu werden. Anstatt die fertige RNA oder die Proteine ​​zu modifizieren, modifiziert INSPECT die Introns.

Das Team demonstrierte die Funktion von INSPECT anhand verschiedener Beispiele von kodierender und nicht kodierender RNA. Sie verfolgten die Produktion von RNA für Interleukin 2, ein Protein, das als Reaktion auf Infektionen in größeren Mengen produziert wird. Sie haben auch eine hochempfindliche Überwachung der Produktion von zwei lncRNAs erreicht und Veränderungen in der Regulierung während des Untersuchungszeitraums verfolgt.

„INSPECT erweitert den biomedizinischen Werkzeugkasten um ein wichtiges molekularbiologisches Werkzeug. Es erleichtert die Untersuchung der Rolle bestimmter nicht-kodierender RNA-Moleküle bei der Zellentwicklung und die Erforschung, wie ihre Regulation moduliert werden kann, um beispielsweise zu verhindern, dass sie in Krebszellen“, sagt Prof. Westmeyer.

„In Kombination mit dem minimal-invasiven Reportersystem EXSISERS, das wir zuvor zur Untersuchung von Protein-Isoformen entwickelt haben, könnte es zukünftig möglich sein, einen gesamten genetischen Regulationsprozess von der RNA-Prozessierung bis zur Produktion spezifischer Proteinvarianten in lebenden Zellen zu untersuchen.“