Viele genetische Krankheiten werden durch verschiedene Mutationen verursacht, die über ein ganzes Gen verteilt sind, und die Entwicklung von Ansätzen zur Genombearbeitung für die Mutation jedes Patienten wäre unpraktisch und kostspielig.
Forscher des Massachusetts General Hospital (MGH) haben kürzlich eine optimierte Methode entwickelt, die die Genauigkeit beim Einfügen großer DNA-Segmente in ein Genom verbessert.
Dieser Ansatz könnte verwendet werden, um ein vollständiges normales oder „Wildtyp“-Ersatzgen einzufügen, das als umfassende Therapie für eine Krankheit wirken könnte, unabhängig von der speziellen Mutation eines Patienten.
Die Arbeit umfasst die Optimierung einer neuen Klasse von Technologien namens CRISPR-assoziierte Transposasen (CASTs), die vielversprechende Werkzeuge für große DNA-Insertionen sind, die über eine reprogrammierbare Leit-RNA leicht an eine gewünschte genomische Stelle gelenkt werden können.
In ihrem natürlichen Zustand haben CASTs jedoch unerwünschte Eigenschaften für Genom-Editing-Anwendungen – nämlich eine suboptimale Produktreinheit (wie oft wird nur die beabsichtigte DNA-Sequenz in das Genom eingefügt) und eine relativ hohe Rate unerwünschter Off-Target-Integration an unbeabsichtigten Stellen in das Genom.
In ihrer Forschung veröffentlicht in Naturbiotechnologieein Team unter der Leitung von Erstautor Connor Tou, einem Doktoranden am MIT und MGH, und dem leitenden Autor Ben Kleinstiver, Ph.D., einem Assistenzforscher am Center for Genomic Medicine am MGH und Assistenzprofessor an der Harvard Medical School, sprach diese Mängel durch Verwendung von Protein-Engineering-Ansätzen zur Modifizierung der Eigenschaften von CAST-Systemen.
Sie fanden heraus, dass die Zugabe eines bestimmten Enzyms namens Nicking Homing Endonuclease zu CASTs zu einer dramatischen Erhöhung der Produktreinheit in Richtung der beabsichtigten Insertion führte.
Eine weitere Optimierung der CAST-Struktur führte zu DNA-Insertionen mit hoher Integrationseffizienz an beabsichtigten genomischen Zielen, mit stark reduzierten Insertionen an unerwünschten Off-Target-Stellen.
Die Forscher nannten das neue und verbesserte System „HELIX“, kurz für Homing Endonuclease-assisted Large-sequence Integrating CAST-compleX.
„Wir haben einen verallgemeinerbaren Ansatz demonstriert, der verwendet werden kann, um eine Vielzahl von CAST-Systemen in sicherere und effektivere Versionen zu modifizieren, die eine hohe Produktreinheit und genomweite Spezifität aufweisen“, sagt Tou.
„Durch die Kombination unserer Erkenntnisse haben wir HELIX-Systeme mit mehr als 96 % On-Target-Integrationsspezifität geschaffen – eine Steigerung gegenüber etwa 50 % für das natürlich vorkommende Wildtyp-CAST-System. Wir haben auch festgestellt, dass HELIX seine vorteilhaften Eigenschaften in menschlichen Zellen beibehält.“ Tu fährt fort.
Kleinstiver merkt an, dass die Technologie Anwendungen haben könnte, die über die Fähigkeit hinausgehen, normale gesunde Gene bei Personen mit krankheitsverursachenden Mutationen wiederherzustellen.
„Darüber hinaus kann die programmierbare DNA-Integration Bemühungen im Zell-Engineering erleichtern, bei denen die Installation großer genetischer Sequenzen an bestimmten Stellen Zellen mit neuen Fähigkeiten ausstatten könnte, während gleichzeitig Sicherheits-, Wirksamkeits- und Herstellungsprobleme vermieden werden, die sich aus traditionellen zufälligen Integrationsansätzen ergeben“, sagt er.
Die Studie ist auch Co-Autor von Benno Orr.
Mehr Informationen:
Connor J. Tou et al, Präzise Cut-and-Paste-DNA-Insertion mit gentechnisch veränderten CRISPR-assoziierten Transposasen vom Typ VK, Naturbiotechnologie (2023). DOI: 10.1038/s41587-022-01574-x