Mit neuer Methode können Forscher Proteine ​​in unmittelbarer Nähe in einzelnen Zellen nachweisen

Heutzutage beruhen die meisten Methoden zur Bestimmung der Proteine ​​in einer Zelle auf einer groben Zählung – Wissenschaftler zermahlen normalerweise eine große Gruppe von Zellen, bevor sie ihr genetisches Material charakterisieren. Aber so wie sich eine Bevölkerung von 100 Einzelpersonen in vielerlei Hinsicht von einer Bevölkerung von 20 Fünf-Personen-Haushalten unterscheidet, kann diese Art der Beschreibung keine Informationen darüber erfassen, wie Proteine ​​interagieren und sich zu funktionellen Gruppen zusammenschließen.

Jetzt haben Forscher der Pritzker School of Molecular Engineering (PME) der University of Chicago einen Ansatz entwickelt, mit dem sie leichter untersuchen können, ob sich Proteine ​​in einer Zelle in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Die Technologie, die gleichzeitig mit einer routinemäßigen Gensequenzierung durchgeführt werden kann, wird in der Zeitschrift beschrieben Naturmethoden.

„Dies ist eine rationalisierte und Hochdurchsatzmethode, um Proteinfunktionen innerhalb einzelner Zellen zu untersuchen“, sagte Savas Tay, Professor für Molekulartechnik und leitender Autor der neuen Arbeit. „Ich denke, diese Methode wird eine wichtige Ressource für die Gemeinschaft der Molekularbiologen sein.“

Fokussiert auf Funktion

In den letzten Jahren haben sich Wissenschaftler mit dem Aufkommen schneller und billiger genetischer Sequenzierungstechnologien der Einzelzell-mRNA-Sequenzierung zugewandt, um Momentaufnahmen des inneren Zellzustands zu erhalten. Durch die Sequenzierung aller mRNA-Moleküle einer Zelle – die für Proteine ​​kodieren – können sie sich ein Bild davon machen, welche Proteine ​​eine Zelle möglicherweise aktiv verwendet. Aber diese Art von Stellvertreter für den Proteinreichtum vermittelt nicht die ganze Geschichte.

„Nur die Fülle bestimmter Proteine ​​zu kennen, gibt Ihnen nicht immer Auskunft darüber, wie eine Zelle funktioniert“, sagte Tay. „Ob Proteine ​​funktionell aktiv sind oder nicht, hat oft nicht nur damit zu tun, ob sie vorhanden sind, sondern auch, ob sie Komplexe bilden.“

Tay wollte erfassen, ob sich Proteine ​​physisch nahe beieinander befinden – und zwar schnell und mit hohem Durchsatz, ohne sich auf die Mikroskopie zu verlassen, um ihre Positionen zu visualisieren oder einige Proteine ​​gleichzeitig für eine genauere Untersuchung zu isolieren.

Er und seine Kollegen entwickelten molekulare Sonden, die an interessierende Proteine ​​binden und deren DNA-Tags sich nach außen erstrecken. Wenn zwei Proteine ​​physisch nahe beieinander liegen, haften diese DNA-Sonden wie Klettverschluss aneinander. Die Forscher können auf diese Weise Experimente aufbauen, die Hunderte von Proteinen gleichzeitig untersuchen. Dann verwenden sie routinemäßige Sequenzierungsmethoden, um alle DNA-Sonden zurückzulesen, die aneinander gebunden sind, und festzustellen, welche Proteine ​​gepaart wurden.

„In dem riesigen Raum innerhalb einer Zelle ist es sehr unwahrscheinlich, dass sich zwei Sonden finden, es sei denn, sie sind an nahe gelegene Proteine ​​​​gebunden“, sagte Tay. „Wenn also die Sonden binden, sagt uns das, dass diese Proteine ​​sehr nahe beieinander liegen.“

Da der als Prox-seq bezeichnete Ansatz Standardsequenzierung verwendet, können Forscher die mRNA einer Zelle gleichzeitig mit den interessierenden Proteinen analysieren, um Fragen zur Korrelation zwischen mRNA und Proteinhäufigkeit und -funktion zu beantworten.

Proof-of-Concept-Studien

Um den Nutzen von Prox-seq zu veranschaulichen, testete Tays Team es zunächst an B-Zellen und T-Zellen, zwei Untergruppen menschlicher Immunzellen. Sie fanden heraus, dass die Technik die Zellen allein auf der Grundlage der Protein-Protein-Wechselwirkungen in jedem Zelltyp differenzieren konnte. Es konnte auch zuvor unbekannte Untergruppen der Zellen identifizieren, basierend auf kleinen Unterschieden in der Organisation von Proteingruppen innerhalb der Zellen. Unter Verwendung menschlicher mononukleärer peripherer Blutzellen maßen sie gleichzeitig 38 einzelne Proteine, 741 Proteinkomplexe und Tausende von mRNA auf jeder einzelnen Zelle und entdeckten einen neuen Proteinkomplex, der naive T-Zellen definiert.

Dann verwendete die Gruppe Prox-seq, um zu untersuchen, wie Proteine ​​ihre Anordnung in Makrophagen, einer anderen Art von Immunzellen, ändern, wenn die Zellen als Reaktion auf einen Krankheitserreger aktiviert werden. Wieder einmal identifizierten sie sowohl bekannte Paare interagierender Proteine ​​als auch neue Gruppen von Proteinen, mit denen nicht nur identifiziert werden kann, ob ein Makrophage aktiviert wurde, sondern auch, welcher Art von Krankheitserregern er ausgesetzt war.

„Dies zeigte, dass unsere Methode nicht nur Protein-Protein-Komplexe verifizieren kann, die wir bereits kannten, sondern auch neue Wechselwirkungen zwischen Proteinen finden kann“, sagte Tay.

Bisher haben die Forscher die Methode nur an Proteinen getestet, die sich auf der Oberfläche von Zellen befinden; Sie arbeiten jetzt daran, es auf weitere Arten von Proteinen auszudehnen, um Wege zu finden, genau zu bestimmen, wo innerhalb einer Zelle Proteine ​​​​interagieren.