Mit Kryo-EM bestimmen Wissenschaftler die Struktur eines Schlüsselfaktors bei der RNA-Qualitätskontrolle

In der Biologie kann es genauso wichtig sein, Dinge loszuwerden, wie sie herzustellen. Eine Ansammlung von Zellen, Proteinen oder anderen Molekülen, die nicht mehr benötigt werden, kann Probleme verursachen, daher haben Lebewesen verschiedene Möglichkeiten entwickelt, um das Haus zu reinigen.

Ein Paradebeispiel ist das RNA-Exosom. RNA-Moleküle erfüllen viele Funktionen in Zellen. Einige von ihnen werden in Proteine ​​übersetzt; andere bilden die Proteinaufbaumaschinerie einer Zelle. Das RNA-Exosom ist eine zelluläre Maschine, die fehlerhafte, schädliche oder nicht mehr benötigte RNA-Moleküle abbaut. Ohne diese mikroskopisch kleine Marie Kondo, um das zu beschneiden, was keine Freude auslöst, würden unsere Zellen zu dysfunktionalen Hamsterern, die nicht funktionieren könnten.

„RNA-Überwachungs- und -Abbauwege existieren in allen Lebensformen“, erklärt Christopher Lima, Vorsitzender des Programms für Strukturbiologie am Sloan-Kettering-Institut. „Von Bakterien bis zum Menschen haben alle Lebewesen Mechanismen, um die Qualität der RNA zu überwachen und gezielt abzubauen.“

Lange Zeit, sagt Dr. Lima, galten diese Wege ebenso wie die Hausarbeit als langweilig. Aber es stellt sich heraus, dass diese Abbauwege stark reguliert sind und alles von der Embryonalentwicklung bis zum Fortschreiten des Zellzyklus kontrollieren.

Darüber hinaus können Fehler in diesen Signalwegen zu vielen Arten von Krankheiten führen, von Krebs bis zur Neurodegeneration.

In einem neuen Papier, das am 9. Juni 2022 in veröffentlicht wurde Zelle, Dr. Lima und M. Rhyan Puno, ein Postdoktorand im Lima-Labor, präsentieren Ergebnisse, die helfen zu erklären, wie das RNA-Exosom die RNA lokalisiert, die abgebaut werden muss. Mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), einer fortschrittlichen Art von Bildgebungstechnologie, konnten die Wissenschaftler die Struktur einer Proteinanordnung namens Nuclear Exosome Targeting (NEXT) Complex entschlüsseln, die ein Schlüsselelement des Abbaus ist Maschinen.

„Wir wussten, dass NEXT auf das Exosom abzielt und RNA an dieses abgibt, aber biochemisch und strukturell hatten wir keine Ahnung, wie es aussieht oder wie es funktioniert“, sagt Dr. Puno.

Jetzt haben die Wissenschaftler mit Kryo-EM die ersten klaren Bilder von NEXT, das an RNA gebunden ist, erhalten. Diese Bilder bieten in Verbindung mit begleitenden biochemischen und biologischen Experimenten Hinweise darauf, wie RNA-Moleküle zur Zerstörung an das Exosom übergeben werden.

Nähern Sie sich einer Struktur

Vor einigen Jahren begann Dr. Puno mit der Untersuchung der Struktur von NEXT unter Verwendung des damaligen Goldstandardansatzes der Röntgenkristallographie. Bei dieser Methode werden Proteine ​​zunächst zu Kristallen verarbeitet, wobei die Proteine ​​alle auf die gleiche Weise ausgerichtet sind. Dann werden Röntgenstrahlen durch die Kristalle geleitet und das Muster der Röntgenstrahlen, die auf einen Detektor treffen, kann interpretiert werden, um die Struktur des Proteins zu bestimmen.

Während Dr. Puno das NEXT-Protein kristallisieren konnte, waren die resultierenden Röntgenbeugungsbilder nicht gut genug, um Details der Struktur zu erkennen.

„Aber dann kam die Kryo-EM-Revolution“, sagt er. „Cryo-EM hat uns geholfen, zu visualisieren, wie dieses Protein aussieht und wie es seine RNA-Substrate bindet.“

Visualisierung von Proteinen in Bewegung

Cryo-EM funktioniert, indem es viele verschiedene Bilder einer gefrorenen, aber nicht kristallisierten Probe eines Proteins aufnimmt und sie dann mithilfe von Computermethoden zu einem endgültigen scharfen Bild ausrichtet.

„Es ist fast so, als würde man ein paar Bilder eines Vogels im Flug aufnehmen“, sagt Dr. Lima. „Es gibt alle möglichen verwirrenden Bewegungen und die Flügel des Vogels können verschwommen aussehen. Aber wenn wir Teile des Flügels in all diesen verschiedenen Bildern finden können, dann können wir die Bilder ausrichten, um zu rekonstruieren, wie die Flügel des Vogels aussehen, und bestimmen, wie sie aussehen.“ Arbeit.“

Aus den Kryo-EM-Bildern konnten die Wissenschaftler erkennen, dass die NEXT-Proteine ​​ein sehr flexibles Dimer bilden – das heißt, zwei Kopien von NEXT-Proteinen verbinden sich zu einer funktionellen Einheit.

„Das war wirklich, wirklich rätselhaft“, sagt Dr. Puno und stellt fest, dass die Dimerbildung für diese Art von Proteinen noch nie zuvor sichtbar gemacht wurde.

„Aus biochemischen Experimenten, die wir durchgeführt haben, wissen wir, dass die Dimerisierung irgendwie wichtig für den Abbau ist“, fährt er fort. „Aber es ist uns immer noch ein Rätsel, welche Rolle das Dimer dabei spielt, die RNA zum Exosom zu leiten.“

Um das Rätsel zu lösen, hoffen sie, den NEXT-Komplex zu erfassen, der bei verschiedenen Schritten im Abbauprozess interagiert, und diese Konformationen dann mit Kryo-EM zu visualisieren.

RNA-Abbau und Krankheit

Es geht um große Einsätze. Wie wichtig der RNA-Abbau ist, zeigt die lange Liste von Krankheiten, die aus einem fehlerhaften oder schlecht kontrollierten Abbau resultieren. Das vielleicht bekannteste Beispiel ist Mukoviszidose. In diesem Fall wird die Boten-RNA, die ein Protein kodiert, das Ionen über Zellmembranen transportiert, durch RNA-Zerfallswege abgebaut. Dadurch kommt das Protein nicht in Schleimhäuten der Lunge vor, was dort zu einer Schleimbildung und damit zu stark eingeschränkter Atmung führt.

„Das ist ein berühmtes Beispiel für eine RNA-Qualitätskontrolle mit schlechten Ergebnissen“, sagt Dr. Lima.

Aber auch Defekte in RNA-Abbauwegen spielen bei einigen Krebsarten eine Rolle. Tatsächlich werden zwei der genetischen Mutationen, auf die die Gentestplattform von MSK, MSK-IMPACT, testet, in Genen gefunden, die mit dem RNA-Exosom-Signalweg in Verbindung stehen, einschließlich eines Proteins in NEXT.

Und es ist nicht nur Boten-RNA, die einer angemessenen Qualitätskontrolle bedarf, erklärt Dr. Lima.

„Die Realität ist, wenn Sie defekte RNA-Qualitätskontrollwege haben, funktionieren Ihre Ribosomen nicht, Ihre Transfer-RNAs funktionieren nicht, Ihre Spleißosomen funktionieren nicht.“ Die Liste geht weiter und weiter.

Die Breite der Funktionen, die RNA erfüllt, erklärt, warum defekte RNA-Abbauwege solche kaskadierenden krankheitsverursachenden Wirkungen haben können.

Um diese Effekte zu verstehen, ist ein tieferes und umfassenderes Verständnis nicht nur des RNA-Exosoms selbst erforderlich, sondern auch der „vorgeschalteten“ Proteine ​​wie NEXT, die dabei helfen, RNA zu überwachen und zu entscheiden, wann eine RNA defekt ist oder nicht mehr benötigt wird.

„Der Traum ist es, die RNA-Abbaureaktion einzuleiten, die Probe in das Kryo-EM zu geben und tatsächlich alle möglichen Bestätigungen zu sehen, während es seine Arbeit macht“, sagt Dr. Lima. „Als Strukturbiologen wollen wir Prozesse in Aktion sehen und sie dann wieder zusammensetzen können.“