Mechanismus der durch Methyltransferase METTL8 vermittelten mitochondrialen RNA-m3C-Modifikation und ihre entspannte Substratspezifität

Eine in der Zeitschrift veröffentlichte Studie Wissenschaftsbulletin wurde von Profs geleitet. Xiao-Long Zhou und En-Duo Wang (CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences).

tRNA ist ein wichtiges Adaptermolekül bei der mRNA-Translation. Es gibt eine große Anzahl posttranskriptioneller Modifikationen der tRNA, die die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Proteinsynthese regulieren. Die Modifikation von 3-Methylcytosin (m3C) findet sich häufig an Position 32 (m3C32) der Anticodon-Schleifen mehrerer zytoplasmatischer und mitochondrialer tRNAs in Eukaryoten.

Eine frühere Studie desselben Labors hat ergeben, dass die m3C32-Modifikation menschlicher zytoplasmatischer tRNAs durch METTL2A/2B und METTL6 vermittelt wurde, während die von menschlichem mitochondrialem tRNAThr (hmtRNAThr) und tRNASer(UCN) (hmtRNASer(UCN)) durch METTL8 katalysiert wird ; Menschlich METTL8 erzeugt durch alternatives Spleißen von mRNA zwei Proteinisoformen unterschiedlicher Länge.

Die lange Form, METTL8-Iso1, wurde gezielt in Mitochondrien eingesetzt, um die m3C32-Modifikation von hmtRNAThr und hmtRNASer(UCN) zu katalysieren; während die kurze Form, METTL8-Iso4, im Nukleolus mit unbekannter Funktion lokalisiert war.

Der einzige Unterschied zwischen den beiden Isoformen ist ein N-terminales Verlängerungspeptid mit 28 Aminosäuren in METTL8-Iso1. Ob METTL8-Iso4 über m3C32-Methyltransferaseaktivität verfügt und welche Rolle die N-terminale Verlängerung von METTL8-Iso1 bei der mitochondrialen tRNA-m3C32-Modifikation spielt, ist unbekannt.

Es ist auch unklar, ob zytoplasmatische oder mitochondriale m3C32-Modifikationsenzyme tRNAs aus verschiedenen Zellkompartimenten gegenseitig erkennen können. Da die meisten tRNA-Modifikationen außerdem m3C32 erfordern N6-Threonylcarbamoyladenosin-Modifikation an Position 37 (t6A37) in der Anticodon-Schleife als Voraussetzung, die Herstellung von tRNA-Molekülen, die nur die m3C32-Modifikation enthalten, wurde nicht vollständig erreicht.

Um diese Fragen zu beantworten, bestätigten die Forscher die Erhaltung der N-terminalen Verlängerung (N-Verlängerung) von METTL8-Iso1 durch multiples Sequenz-Alignment. Die Bestimmung der Enzymaktivität in vitro ergab, dass METTL8-Iso4 keine m3C32-Modifikationsaktivität aufwies. Sie bewiesen außerdem, dass die N-Verlängerung von METTL8-Iso1 als wichtiges tRNA-Bindungselement im katalytischen Prozess fungierte.

Es wurden zwei vollständig konservierte Aminosäurereste in allen METTL2A/2B/8-Proteinen identifiziert. METTL8-Iso1 war in der Lage, die m3C32-Modifikation sowohl für das Zytoplasma als auch für das Zytoplasma zu vermitteln E coli tRNAs, die nicht auf t6A37 angewiesen waren.

Die zytoplasmatischen m3C32-Modifikationsenzyme METTL2A und METTL6 waren jedoch nicht in der Lage, die m3C32-Modifikation der mitochondrialen tRNA zu katalysieren, was darauf hindeutet, dass METTL8-Iso1 eine entspanntere Substratspezifität aufweist. Die m3C32-Modifikation hatte keinen Einfluss auf die t6A37-Modifikation und die Aminoacylierungsgrade von hmtRNAThr.

Schließlich zeigten sie auch, dass METTL8-Iso1 mit der mitochondrialen Seryl-tRNA-Synthetase (SARS2) bzw. der mitochondrialen Threonyl-tRNA-Synthetase (TARS2) interagierte und die Aminoacylierungsaktivität von SARS2 und TARS2 deutlich förderte.

Zusammenfassend enthüllt diese Arbeit den molekularen Mechanismus der durch METTL8 vermittelten mitochondrialen tRNA m3C32-Biogenese, die auf einer spezifischen N-Verlängerung als Schlüsselelement für die RNA-Bindung beruht. METTL8 hatte ein breites Spektrum an heterogen tRNA-Substrate, die eine Grundlage für die Herstellung von tRNAs bildeten, die nur eine m3C-Einheit enthielten. Diese Arbeit liefert ein umfassendes Verständnis der Konservierung und des Unterschieds zwischen zytoplasmatischer und mitochondrialer tRNA-m3C-Modifikation.