Wenn sich Zellen reproduzieren, machen es die internen Mechanismen, die die DNA kopieren, fast immer richtig. Biowissenschaftler der Rice University haben ein winziges Detail entdeckt, das hilft zu verstehen, wie der Prozess schief gehen könnte.
Ihre Untersuchung von Enzymen ergab, dass das Vorhandensein eines zentralen Metallions, das für die DNA-Replikation entscheidend ist, anscheinend auch mit dem Fehleinbau, der fehlerhaften Anordnung von Nukleotiden auf neuen Strängen, in Verbindung gebracht wird.
Die Beobachtung berichtet in Naturkommunikation könnte helfen, Behandlungen für genetische Mutationen und die von ihnen verursachten Krankheiten, einschließlich Krebs, zu finden.
Der Reisstrukturbiologe Yang Gao, der Doktorand Caleb Chang und die Alumna Christie Lee Luo verwendeten zeitaufgelöste Kristallographie, um die flexiblen Enzyme namens Polymerase zu analysieren, während sie sich biegen und verdrehen, um schnell komplette DNA-Stränge aus einem Pool von C, G, A und T wieder zusammenzusetzen Nukleotide.
Alle Proteine, die an der DNA-Replikation beteiligt sind, sind auf Metallionen – entweder Magnesium oder Mangan – angewiesen, um die Übertragung von Nukleotiden an ihre richtigen Positionen entlang des Strangs zu katalysieren, aber ob zwei oder drei Ionen beteiligt waren, ist seit langem umstritten.
Das Rice-Team scheint dies durch die Untersuchung einer als Eta bekannten Polymerase geklärt zu haben, einem Transläsionssyntheseenzym, das vor UV-induzierten Läsionen schützt. Diejenigen mit Mutationen auf dem Poly-eta-Gen haben laut den Forschern oft eine Veranlagung für Xeroderma pigmentosum und Hautkrebs.
Gao sagte, dass typische Polymerasen einer rechtshändigen Form ähneln, und er denkt an sie wie eine echte Hand: „Sie haben eine Handflächendomäne, die das aktive Zentrum enthält, eine Fingerdomäne, die sich schließt, um mit dem neuen Basenpaar zu interagieren, und eine Daumendomäne, die die Primer-/Matrizen-DNA bindet“, sagte er.
Wenn in diesem Modell das falsche Substrat, dGTP, zusammen mit dem ersten Metallion in das Enzym eintritt, klappt der Primer nach oben und richtet sich falsch auf sein Ziel aus, ein Phosphatatom auf dem dGTP-Substrat. In diesem Zustand bilden das falsche Substrat dGTP und das Templat dT eine abnormale Form, die als Wobble-Basenpaar bezeichnet wird. Danach zieht das zweite Metallion den Primer in Ausrichtung mit seinem Ziel. Wenn sich der Primer auszurichten beginnt, bindet das dritte Metallion in der Nähe von zwei Sauerstoffatomen an der Phosphatregion des dGTP-Substrats. Anschließend fängt das dritte Metallion diese beiden Sauerstoffatome ab, bricht diese Bindung auf und bildet gleichzeitig eine Bindung zwischen dem Primer und dem falschen Substrat. Bildnachweis: Caleb Chang
Aber bisher konnten Wissenschaftler nur einige Details des gut versteckten Mechanismus erahnen, mit dem Polymerasen ihre Arbeit verrichten und gelegentlich versagen. Die Art der zeitaufgelösten Kristallographie, die in Gaos Labor verwendet wurde, ermöglichte es den Forschern, in 34 Zwischenstufen kristallisierte Proteine zu analysieren, um die Positionen ihrer Atome vor, während und nach der DNA-Synthese zu bestimmen.
„Diese kinetische Reaktion ist schwer zu erfassen, weil es viele Atome gibt und sie sehr schnell arbeiten“, sagte Gao, ein Assistenzprofessor für Biowissenschaften, der 2019 als CPRIT-Stipendiat zu Rice kam. „Wir haben nie gewusst, wie sich die Atome zusammen bewegen weil die räumliche Information fehlte. Durch das Einfrieren der Proteine und eines kleinen Molekülsubstrats können wir diese katalytische Reaktion zum ersten Mal erfassen.“
Die Studie führte zu ihrer Theorie, dass das erste der drei Metallatome in eta die Nukleotidbindung unterstützt und das zweite der Schlüssel ist, um das Nukleotid und den Primer auf Kurs zu halten, indem es die Bindung loser Nukleotide an den Primer stabilisiert, der sich auf der vorhandenen Hälfte von befindet der neue Strang (auch bekannt als das Substrat). Primer sind kurze DNA-Stränge, die markieren, wo Polymerasen mit der Aneinanderreihung neuer Nukleotide beginnen.
„Nur wenn die ersten beiden Metallionen unter Kontrolle sind, kann das dritte kommen und die Reaktion nach Hause treiben“, sagte Chang und deutete an, dass der Prozess unter Polymerasen universell sein könnte.
Die Forscher stellten auch fest, dass Poly-eta ein Motiv enthält, das es anfällig für eine Fehlausrichtung von Primern macht, was zu einer größeren Wahrscheinlichkeit eines Fehleinbaus führt.
„Hier geht es zunächst um einen grundlegenden Mechanismus des Lebens“, sagte Gao. „DNA muss genau kopiert werden, und Fehler können zu menschlichen Krankheiten führen. Menschen, die diese Enzyme untersuchen, wissen, dass sie bei der DNA-Synthese immer viel, viel besser abschneiden, als sie sollten, weil ihnen nur eine sehr begrenzte Menge an Energie zur Verfügung steht das richtige Basenpaar.“
Für Gao besteht der eigentliche Vorteil darin, die Fähigkeit der zeitaufgelösten Kristallographie zu beweisen, einen gesamten katalytischen Prozess im atomaren Detail zu beobachten.
„Damit können wir genau sehen, was in einem dynamischen katalytischen Prozess im Laufe der Zeit passiert“, sagte er.
Caleb Chang et al., In Crystallo-Beobachtung von drei Metallionen geförderter DNA-Polymerase-Fehleinbau, Naturkommunikation (2022). DOI: 10.1038/s41467-022-30005-3