Die korrelative Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) ist ein leistungsstarkes Werkzeug in der Biobildgebung, da sie die Fähigkeit, lebende Zellen über große Sichtfelder mit molekularer Spezifität unter Verwendung der Lichtmikroskopie (LM) abzubilden, mit der hohen räumlichen Auflösung und den ultrastrukturellen Informationen der Elektronenmikroskopie (EM) kombiniert ). Um interessierende Biomoleküle hervorzuheben und ihre Position mit hoher Genauigkeit in CLEM zu bestimmen, müssen Forscher sicherstellen, dass sie mit Sonden markiert sind, die sowohl in LM (typischerweise durch Fluoreszenz) als auch in EM (unter Verwendung von elektronendichtem Material) sichtbar sind. Existierende Sonden haben jedoch eine Reihe von Nachteilen, einschließlich mangelnder Stabilität unter LM (Photobleichung) und mangelnder Integrität.
In einem neuen Artikel, erschienen in Lichtwissenschaft & Anwendungein Team von Wissenschaftlern unter der Leitung von Professor Paola Borri von der Cardiff University und Professor Paul Verkade von der University of Bristol, Vereinigtes Königreich, hat einen neuen CLEM-Ansatz entwickelt, der kleine Goldnanopartikel als einzelne Sonde verwendet, die sowohl in LM als auch in EM mit hoher sichtbar ist Kontrast und Photostabilität, ohne dass fluoreszierende Sonden verwendet werden müssen.
Für LM nutzten sie ein optisches Mikroskop, das in der Gruppe von Professor Borri entwickelt wurde. Dieses Mikroskop erkennt die nichtlineare optische Reaktion von Goldnanopartikeln, die als Vierwellenmischung (FWM) bezeichnet wird. Mit dieser Methode konnten die Forscher einzelne kleine Gold-Nanopartikel als Einzelsonden des epidermalen Wachstumsfaktorproteins in menschlichen Krebszellen nachweisen, hintergrundfrei lichtmikroskopisch nanometergenau verorten und korrelativ mit hoher Genauigkeit auf das entsprechende Transmissionselektron abbilden Mikroskopbild.
Aufgrund der hintergrundfreien und photostabilen FWM-Antwort einzelner Goldnanopartikel, die aufgrund ihrer elektronendichten Zusammensetzung in EM gut sichtbar sind, eröffnet FWM-CLEM neue Wege für hochpräzise Arbeitsabläufe in der korrelativen Mikroskopie, ohne dass instabile Fluorophore oder zusätzliche Referenzmarker verwendet werden müssen. Dadurch werden die Protokolle zur Probenvorbereitung erheblich vereinfacht.
Die Wissenschaftler fassen das Funktionsprinzip ihres FWM-Mikroskops wie folgt zusammen: „In seiner allgemeinen Form ist FWM ein nichtlineares Licht-Materie-Wechselwirkungsphänomen dritter Ordnung, bei dem drei Lichtfelder in einem Medium interagieren, um eine vierte Welle zu erzeugen. Hier, wir Verwenden Sie ein Schema, bei dem alle Lichtwellen die gleiche Mittenfrequenz haben, in Resonanz mit dem optischen Absorptionspeak eines Gold-Nanopartikels.Zur Anregung und Detektion verwenden wir eine Kombination aus kurzen optischen Impulsen von etwa 150 fs Dauer, Pump und Probe genannt, die von erzeugt werden die gleiche Laserquelle.Die detektierte FWM kann als eine pumpinduzierte Änderung in der Fähigkeitdes Goldnanopartikels verstanden werden, Licht zu übertragen und zu streuen, wassich als eine Änderung des Sondenstrahls manifestiert, der durch das Partikelin Gegenwart der Pumpe gestreut wird.
„Die FWM-Detektion ist bemerkenswert photostabil und kontrastreich. Mit dieser Methode sind wir in der Lage, einzelne kleine Goldnanopartikel (mit einem Radius von bis zu 5 nm) in streuenden und autofluoreszierenden Zellen und Geweben vollständig hintergrundfrei bei Bildgebungsgeschwindigkeiten und Anregungsleistungen zu erkennen, die kompatibel sind B. mit Live-Cell-Imaging, mit einer Empfindlichkeit, die nur durch Photonenschussrauschen begrenzt ist. Wir haben auch gesehen, dass FWM ein empfindlicher Reporter von Goldnanopartikelformen ist, was für Multiplexing durch Formerkennung in zukünftigen Anwendungen vielversprechend ist.
Die Forscher kommen zu dem Schluss: „FWM-CLEM eröffnet neue aufregende Möglichkeiten für Arbeitsabläufe in der korrelativen Lichtelektronenmikroskopie und überwindet bestehende Einschränkungen mit fluoreszierenden Sonden und/oder Bezugsmarkern, die in unserer Methode nicht benötigt werden. Wir glauben im Allgemeinen, dass FWM-CLEM eine weite Verbreitung finden wird In Kombination mit bestehenden Strategien zum Markieren oder sogar Einkapseln von Goldnanopartikeln in Virionen eröffnet FWM die aufregende Aussicht, einzelne Virionen über lange Beobachtungszeiten hinweg hintergrundfrei und tief in lebenden Zellen und Geweben zu verfolgen und dann zu lokalisieren Ereignisse von Interesse (z. B. Genomfreisetzung) im Zusammenhang mit der zellulären Ultrastruktur durch CLEM.“
Mehr Informationen:
Iestyn Pope et al, Korrelative Lichtelektronenmikroskopie mit kleinen Goldnanopartikeln als Einzelsonden, Licht: Wissenschaft & Anwendungen (2023). DOI: 10.1038/s41377-023-01115-4