Kompakte „Genschere“ ermöglicht effektive Genom-Editierung und könnte künftig Behandlung von Gendefekten bei hohem Cholesterinspiegel ermöglichen

CRISPR-Cas wird in Forschung und Medizin breit eingesetzt, um Gene in Organismen zu bearbeiten, einzufügen, zu löschen oder zu regulieren. TnpB ist ein Vorfahre dieser bekannten „Genschere“, ist aber viel kleiner und lässt sich daher leichter in Zellen transportieren.

Mithilfe von Protein-Engineering und KI-Algorithmen haben Forscher der Universität Zürich nun die Fähigkeiten von TnpB verbessert, um die DNA-Editierung effizienter und vielseitiger zu gestalten. Damit wird der Weg für die zukünftige Behandlung eines genetischen Defekts bei hohem Cholesterin geebnet. Die Arbeit wurde veröffentlicht In Naturmethoden.

CRISPR-Cas-Systeme, die aus Protein- und RNA-Bausteinen bestehen, wurden ursprünglich als natürlicher Abwehrmechanismus von Bakterien gegen eindringende Viren entwickelt. Im letzten Jahrzehnt hat die Neuentwicklung dieser sogenannten „Genschere“ die Gentechnik in Wissenschaft und Medizin revolutioniert.

Die Werkzeuge können so programmiert werden, dass sie eine bestimmte Stelle in unserer DNA finden und die genetische Information gezielt bearbeiten. So kann zum Beispiel eine krankheitsverursachende Mutation in der DNA in ihren gesunden Zustand zurückversetzt werden.

Viel kleineres Werkzeug zur Genom-Editierung

Kürzlich wurde entdeckt, dass sich Cas-Proteine ​​aus viel kleineren Proteinen entwickelt haben, wobei TnpB der Vorläufer von Cas12 ist. Da die Größe von Cas-Proteinen es schwierig macht, sie an die richtigen Körperzellen zu liefern, haben neuere Studien versucht, ihre kleineren evolutionären Vorläufer als Werkzeug zur Genombearbeitung zu nutzen.

Das Problem dieser kleinen Alternativen: Sie funktionieren weniger effizient. Diese Hürde hat nun ein Forschungsteam um Gerald Schwank vom Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Zürich (UZH) gemeinsam mit Kollegen der ETH Zürich überwunden.

„Durch die Entwicklung des kleinen, aber leistungsstarken Proteins TnpB konnten wir eine Variante entwickeln, die eine 4,4-fach höhere Effizienz bei der Modifizierung von DNA aufweist – und damit als Werkzeug zur Genbearbeitung effektiver ist“, sagt Schwank.

TnpB-Proteine ​​kommen in einer Vielzahl von Bakterien und Archaeen vor. Das von den Forschern untersuchte TnpB stammt aus dem Bakterium Deinococcus radiodurans. Diese Mikrobe überlebt Kälte, Dehydrierung, Vakuum und Säure und ist einer der strahlungsresistentesten Organismen, die der Mensch kennt.

Es wurde bereits gezeigt, dass das kompakte TnpB-Protein für die Genombearbeitung in menschlichen Zellen funktioniert, wenn auch mit geringer Effizienz und eingeschränkter Zielgenauigkeit aufgrund der Erkennungsanforderungen bei der Bindung von DNA.

Bessere Bindungsfähigkeit und breiteres Spektrum an DNA-Zielsequenzen

Daher optimierten die Forscher TnpB so, dass es die DNA von Säugetierzellen effizienter bearbeitet als das ursprüngliche Protein.

„Der Trick bestand darin, das Werkzeug auf zwei Arten zu modifizieren: Erstens, so dass es effizienter zum Zellkern gelangt, wo sich die genomische DNA befindet, und zweitens, so dass es auch alternative Genomsequenzen anvisiert“, sagt Kim Marquart, Doktorandin in Schwanks Labor und Erstautorin der Studie.

Um herauszufinden, welche Merkmale in den DNA-Sequenzen der Zielstellen die Effizienz der Genom-Editierung bestimmen, testeten die Forschenden TnpB an 10.211 verschiedenen Zielstellen. In Zusammenarbeit mit dem Team von Michael Krauthammer, ebenfalls Professor an der UZH, entwickelten sie ein neues künstliches Intelligenzmodell, das die Effizienz der TnpB-Editierung an jeder beliebigen Zielstelle vorhersagen kann.

„Unser Modell kann vorhersagen, wie gut TnpB in verschiedenen Szenarien funktionieren wird, wodurch es einfacher und schneller wird, erfolgreiche Experimente zur Genomeditierung zu entwerfen. Mithilfe dieser Vorhersagen erreichten wir eine Effizienz von bis zu 75,3 % in Mäuselebern und 65,9 % in Mäusegehirnen“, fügt Marquart hinzu.

Gen-Editing-Therapie bei Gendefekt und hohem Cholesterinspiegel

„Für die Tierversuche konnten wir klinisch einsetzbare Adeno-assoziierte virale Vektoren verwenden, um die Werkzeuge effizient in Mauszellen zu transportieren. Aufgrund seiner geringen Größe kann das TnpB-Gen-Editierungssystem in ein einzelnes Viruspartikel verpackt werden“, sagt Marquart.

Im Gegensatz dazu müssen die CRISPR-Cas9-Komponenten in mehrere Viruspartikel verpackt werden, was bedeutet, dass höhere Vektordosen angewendet werden müssen.

Im aktuellen Projekt untersuchten die Forscher, ob das TnpB-Tool zur Behandlung von Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie eingesetzt werden kann. Diese genetische Krankheit führt zu lebenslang stark erhöhtem Cholesterinspiegel und betrifft weltweit etwa 31 Millionen Menschen. Die Krankheit erhöht das Risiko einer frühzeitigen atherosklerotischen Herz-Kreislauf-Erkrankung.

„Wir konnten ein Gen bearbeiten, das den Cholesterinspiegel reguliert, und dadurch den Cholesterinspiegel bei den behandelten Mäusen um fast 80 Prozent senken. Ziel ist es, ähnliche Strategien zur Genbearbeitung beim Menschen zu entwickeln, um Patienten mit Hypercholesterinämie zu behandeln“, sagt Schwank.