In-situ-Mikroskopie ermöglicht Einblicke in Mitochondrien auf atomarer Ebene

Dank einer neuartigen hochauflösenden Mikroskopietechnologie können Forscher erstmals die dynamischen Prozesse der Atmung in einer natürlichen Membranumgebung auf atomarer Ebene beobachten. Die neue Technik könnte Forschern dabei helfen, besser zu verstehen, was in den Mitochondrien und anderen Organellen erkrankter Zellen vor sich geht, und neue, präzisere Wirkstoffziele zu identifizieren.

In einer neuen Studie veröffentlicht In Natur Am 29. Mai entwickelten Forscher durch die Integration zweier Mikroskopietechniken – Einzelpartikelanalyse und Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) – einen neuartigen Bildgebungsansatz, um Mitochondrien von Tiermodellen abzubilden.

Sie entwickelten außerdem neuartige rechnergestützte Ansätze, um Engpässe bei der hochauflösenden Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Analyse von Bildern aus der dicht besiedelten Umgebung zu beseitigen.

Mithilfe dieser Technologie konnte das Team Proteinansammlungen in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Organelle mit beispielloser Auflösung betrachten. Sie untersuchten auch, wie die Herbeiführung einer Krankheit in diesen Modellen die Strukturen dieser Proteine ​​innerhalb der Mitochondrienmembran veränderte. Ihre Arbeit ebnet den Weg für die Betrachtung der Zusammensetzung von Molekülen innerhalb von Zellen auf atomarer Ebene.

„Bisher war unsere Technologie nicht in der Lage, aufzudecken, wie Interaktionen stattfinden“, sagt Dr. Jack Zhang, Assistenzprofessor für Molekularbiophysik und Biochemie und Hauptforscher der Studie. „Aber in diesem Fall sehen wir die Atome, wir sehen die Strukturen der Moleküle und wir sehen, wie alles interagiert, was uns ein völlig neues Verständnis der Mechanismen in der Zellumgebung gibt.“

Kombination zweier Mikroskopiekonzepte zur Erzeugung hochauflösender Bilder

Derzeit sind Strukturbiologen entweder durch die Auflösung oder die erreichbaren Zielgrößen der verfügbaren Mikroskopietechniken eingeschränkt. „Wir sind noch nicht einmal in der Lage, Proteinuntereinheiten zu unterscheiden. [using conventional approaches]ganz zu schweigen von atomaren Details in Zellumgebungen“, sagt Zhang.

Die Leistung des Yale-Teams wurde durch die Kombination der Konzepte der Kryo-EM- und Kryo-ET-Technologien zur Einzelpartikelanalyse sowie durch die Entwicklung einer neuen Bildanalysemethode zur Analyse hochauflösender zellulärer Kryo-EM-Bilder im Kryo-ET-Maßstab möglich.

„Die Einzelpartikelanalyse eignet sich hervorragend für die Abbildung einzelner Moleküle, aber nicht für Zellstrukturen“, erklärt Zhang. „Die Kryo-Elektronentomographie ist ein perfektes Werkzeug zur Untersuchung von Zellstrukturen, aber ihre Auflösung ist normalerweise auf einige Nanometer begrenzt.“

Sie bewältigten diese technische Herausforderung, indem sie einen Ansatz zur Abbildung von Kryo-ET-Zielen im Einzelpartikelmodus entwickelten und dabei Kryo-ET-Rekonstruktionen als erste Referenzen für die nachfolgende Ausrichtung und Klassifizierung der Einzelpartikel verwendeten.

Eine weitere Einschränkung der herkömmlichen Einzelpartikel-Kryo-EM besteht darin, dass Forscher die betreffenden Proteine ​​normalerweise isolieren und reinigen müssen, bevor sie sie einfrieren und auf Kryo-EM-Gittern montieren können, wodurch die Moleküle aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt werden.

Dieser Prozess zerstört schwach zusammengesetzte biologische Komplexe höherer Ordnung sowie Reaktionen unter physiologischen Bedingungen. Dies ist insbesondere bei Membranproteinen wichtig, da gereinigte Proben mit Detergens die native Membranumgebung, die für ihre normalen Funktionen entscheidend ist, vollständig zerstören würden.

Durch die Kombination dieser Mikroskopieansätze und die Entwicklung neuartiger Computermethoden gelang es dem Team, Bilder sowohl in Einzelpartikelauflösung als auch im Kryo-ET-Maßstab zu erstellen und diese beiden Auflösungen dann mithilfe innovativer Algorithmen zu verbinden. So konnten die Forscher Molekülstrukturen mit einer bisher unerreichten Detailgenauigkeit betrachten.

Insbesondere ermöglichte ihnen ihre Technik erstmals, die Strukturen von Membranproteinen in ihren natürlichen Mitochondrien zu betrachten – und die natürliche Zusammensetzung und Funktion der Proteine ​​innerhalb des gesamten Organells zu verfolgen.

Forscher visualisieren mitochondriale Superkomplexe im atomaren Detail

Mithilfe ihrer neuen Mikroskopietechnik bildeten die Forscher Mitochondrien aus Herzmodellen von Tieren direkt ab, um mitochondriale Atmungssuperkomplexe zu untersuchen. Dabei handelt es sich um Proteinansammlungen, die in der inneren Membran der Organelle leben und eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion spielen.

Zum ersten Mal gelang es dem Team, die Strukturen dieser Superkomplexe im atomaren Detail zu betrachten, ohne sie von den Mitochondrien isolieren zu müssen. Besonders bemerkenswert war, dass die Auflösung sogar die direkte Beobachtung einzelner Wassermoleküle ermöglichte, die mit diesen Komplexen assoziiert sind.

Da sich alle diese Superkomplexe in ihrer natürlichen Umgebung befanden, die sich von gereinigten Proteinen unterscheidet, war das Team in der Lage, die Strukturen der zahlreichen reaktiven Zwischenprodukte während ihrer Funktion in den Mitochondrien auf atomarer Ebene zu visualisieren.

„Mithilfe einer neuartigen Klassifizierungsstrategie sehen wir, wie Proteine ​​auf ihre Umgebung reagieren und erfassen verschiedene Zwischenzustände“, sagt Zhang.

Herkömmliche Ansätze liefern nur Informationen über die Position von Molekülen oder ihre Gesamtform in zellulärer Umgebung mit niedriger Auflösung. Dieser neue Ansatz hat erhebliche pharmazeutische und klinische Auswirkungen. „Er kann uns helfen zu untersuchen, wie Moleküle in ihren nativen Zellen auf bestimmte Medikamente reagieren“, sagt Zhang.

Den Weg für die Entwicklung neuartiger und wirksamerer Arzneimittel ebnen

Diese Mikroskopietechnologie könnte auch bahnbrechend sein, wenn es darum geht, die zugrundeliegenden Mechanismen verschiedener Krankheiten zu verstehen. Um dies weiter zu erforschen, erstellte das Yale-Team Tierherzmodelle verschiedener Stadien der Myokardischämie, einer kardiovaskulären Erkrankung, bei der eine Blockade den Blutfluss zum Herzen behindert.

Sie stellten fest, dass die verschiedenen Krankheitsstadien erhebliche Veränderungen der Konformationsverteilung und der Form der Superkomplexe und ihrer nativen Membranen verursachten.

Experten, die die Arbeit des Zhang-Teams im Auftrag von überprüften Natur schrieb: „Diese bahnbrechende Arbeit setzt neue Maßstäbe in der Strukturbiologie“ und: „Zukünftige Arbeiten werden das enorme Potenzial dieses neuen Ansatzes ausschöpfen.“

In Zukunft kann die Technik des Yale-Teams den Forschern völlig neue Einblicke in das Geschehen im Inneren normaler und erkrankter Zellen ermöglichen und so letztendlich den Weg für die Entwicklung hochpräziser Therapien ebnen, die auf neu entdeckte molekulare Signalwege oder Strukturen abzielen.

Dies ist insbesondere bei Membranproteinen von Bedeutung, da sie aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zell-Zell-Kommunikation, der Interaktion zwischen Krankheitserreger und Wirt und der Signalübertragung, entscheidende Zielmoleküle für Medikamente sind. Zudem sind sie für Medikamente leicht zugänglich, weisen eine hohe Spezifität und Selektivität auf, sind vielfältig und haben ein erhebliches therapeutisches Potenzial.

Zhangs Team möchte diese Technologie bereits in die Erforschung verschiedener Krankheitsmodelle einbringen, darunter Tiermodelle und möglicherweise Spendergewebe, um zu untersuchen, was in diesen verschiedenen Kontexten im Inneren der Zellen geschieht. „Indem wir unsere Studien auf medizinische Anwendungen ausweiten, können wir beispiellose Details darüber liefern, was in kranken Zellen geschieht, sodass wir bessere Medikamente und Behandlungsmöglichkeiten entwickeln können.“