Hunderte von genregulatorischen Motiven kooperieren und widerstreiten, um Gehirnzellen zu bilden

Die DNA gilt als Bauplan unseres menschlichen Körpers. Es kodiert für Zehntausende von Genen, die darüber entscheiden, ob sich eine Zelle in eine Gehirnzelle, eine Herzzelle oder sogar eine Krebszelle verwandelt. Andere DNA-Sequenzen, sogenannte Enhancer, bestimmen, ob Gene aktiviert oder inaktiviert werden. In einer neuen Studie in gesehen NaturkommunikationASHBi Associate Professor Fumitaka Inoue und Kollegen in den Vereinigten Staaten berichten über den „Massively Parallel Reporter Perturbation Assay“, um zu untersuchen, wie Enhancer im Laufe der Zeit während der Erzeugung von Gehirnzellen fein abgestimmt werden.

Enhancer bestimmen, wann, wo und in welchem ​​Ausmaß ein Gen angeschaltet wird. Enhancer selbst werden durch Transkriptionsfaktoren reguliert, die auf regulatorische Motive in der Enhancer-Sequenz abzielen. Daher sind Wechselwirkungen zwischen Enhancern und Transkriptionsfaktoren entscheidend für die Verstärkung oder Unterdrückung der Gene, die das Schicksal und Verhalten einer Zelle bestimmen.

„Enhancer haben wichtige Auswirkungen auf die Genexpression und bestimmen damit, ob Zellen in verschiedene Organe hineinwachsen. Trotz ihrer Folgen wissen wir jedoch relativ wenig über die Funktionsweise von Enhancern“, erklärt Inoue.

Zur Untersuchung von Enhancern stehen eine Reihe von biochemischen Assays zur Verfügung, aber Massively Parallel Reporter Assays (MPRA) ermöglichen die quantitative Analyse von Tausenden von Enhancern gleichzeitig.

„MPRA sind nützlich, um das Zusammenspiel zwischen Enhancern und Transkriptionsfaktoren zu untersuchen. Um noch mehr Informationen aus den Assays zu extrahieren, haben wir die Assays modifiziert, um Störungen in die regulatorischen Motive einzuführen, an denen Transkriptionsfaktoren binden“, fährt Inoue fort.

Diese Störungen wurden in mehreren regulatorischen Motiven in Tausenden von Enhancer-Sequenzen eingeführt. Anschließend wurde MPRA angewendet, um die Auswirkungen der Störungen auf die Enhancer-Aktivität zu untersuchen und so systematisch zu identifizieren, welche regulatorischen Motive für die Genaktivierung oder -inaktivierung wichtig sind.

Um ihren Massively Parallel Reporter Perturbation Assay zu validieren, wendete das Team ihn auf die Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen in neurale Zellen an. Sie fanden 598 regulatorische Motive, die die Transkription entweder verstärkten oder dämpften.

„Wir haben diese Motive in vier Gruppen eingeteilt. Essentielle und beitragende Motive waren entweder erforderlich oder trugen zur Aktivierung bei. Ebenso waren stummschaltende und hemmende Motive erforderlich oder trugen dazu bei, die Transkription zu dämpfen“, sagt Inoue.

Weitere Untersuchungen ergaben, dass unter den verstärkten oder gedämpften Genen viele an der Förderung der neuralen Differenzierung oder der Pluripotenz von Stammzellen beteiligt sind. Darüber hinaus stellte der Assay klar, dass in den meisten Fällen die regulatorischen Motive bestimmten, ob die Transkription verstärkt oder gedämpft wurde, aber das Timing der Störung das Ausmaß der Wirkung bestimmte. Insgesamt, so Inoue, demonstrieren die Ergebnisse ein kompliziertes Netzwerk regulatorischer Sequenzen, die miteinander interagieren, um eine neuronale Differenzierung zu erreichen.

„Die größte Errungenschaft des Assays ist die Anzahl der Sequenzen, die wir analysieren konnten, und der Störungen, die wir anwenden konnten. Als Ergebnis haben wir die Komplexität vieler Modelle dafür demonstriert, wie Transkriptionsfaktoren die Genexpression regulieren“, sagte er.