Die Austern sind als repräsentative Muscheln weit verbreitet und unterstützen die wichtigsten Aquakultur- und Fischereiindustrien weltweit. Austern befinden sich jedoch noch in einem frühen Stadium der Domestizierung.
Kürzlich schlug ein Forschungsteam unter der Leitung von Prof. Zhang Linlin vom Institut für Ozeanologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (IOCAS) eine hochwirksame CRISPR-vermittelte Gen-Editierungstechnik in der Zuchtauster vor, die ein leistungsstarkes Werkzeug zur Verbesserung der gentechnischen Züchtung darstellt produktive Merkmale bei Austern und anderen Aquakulturarten.
Ihre Ergebnisse wurden in veröffentlicht Grenzen in der Meereswissenschaft am 26. Mai.
Die Forscher führten einen CRISPR-vermittelten Knockout durch Elektroporation in Crassostrea gigas angulate mit β-Tubulin als Markergen durch. Sie entdeckten Deletionen langer Fragmente im Zielgen und beobachteten Mosaikmutationen einschließlich defekter Zilien und verminderter Beweglichkeit in den Larven der ersten Generation.
Die bisherige Strategie erzeugt hauptsächlich kleine Indels, die durch einzelne sgRNA-Spaltung erzeugt werden, die normalerweise während der Genotypisierung zeitaufwändig sind. Die in dieser Studie verwendete Strategie co-injizierte mehr als zwei kleine Leit-RNAs (sgRNAs) mit dem Ziel, lange Fragmentdeletionen zu erzeugen, was die Editiereffizienz erheblich erhöht und den Mutanten-Genotypisierungs-Workflow vereinfacht, indem ein normales Agarosegel ausgeführt wird. In dieser Studie wurde eine lange Fragment-Deletion von mehr als 300 bp im Zielgen nachgewiesen.
Mosaike, die aus der CRISPR/Cas9-Genombearbeitung in Tiermodellen resultieren, sind wertvoll. Das Team produzierte Mosaik-Mutagenese mit nicht tödlichen, aber leicht beobachtbaren phänotypischen Effekten. β-Tubulin-Knockout-vermittelte mosaikartige Expressionsmuster von Cgβ-Tubulin und mosaikartige Ziliardefekte wurden an den Positionen von Peritroch, intestinalen Zilien und dem hinteren Zilienring in C. gigas angulate-Larven beobachtet.
„Die Anwendung von Genom-Editing-Technologien bei Austern erfordert die Einrichtung eines effizienten CRISPR/Cas9-Mutagenesewerkzeugs, das signifikante fehlerhafte Phänotypen erzeugen kann“, sagte Dr. Chan Jiulin, Erstautor der Studie.
Die Forscher führten den CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockout durch Elektroporation durch und beobachteten die Deletionen langer Fragmente und Mosaikmutationen in den Larven der ersten Generation von kultivierten Austern. Die vorgeschlagene Strategie erhöht die Effizienz der Mutagenese, vereinfacht den Arbeitsablauf der Genombearbeitung und stellt ein neues Werkzeug im Mollusken-Experimentalsystem für Genfunktionsstudien bereit.
„Die Anwendung der CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Editing-Technologie bei Meeresmollusken steht immer noch vor Herausforderungen, entweder in der genfunktionellen oder gentechnischen Züchtung. Diese Studie kann eine nützliche Referenz für eine weit verbreitete Anwendung der Gen-Editing-Technologie bei Mollusken in der Zukunft liefern.“ sagte Prof. Zhang.
Jiulin Chan et al., Electroporation-Based CRISPR/Cas9 Mosaic Mutagenese of β-Tubulin in the Cultured Oyster, Grenzen in der Meereswissenschaft (2022). DOI: 10.3389/fmars.2022.912409