Hitzestabiles Cas13-Enzym könnte zu verbesserter Diagnostik und neuen biotechnologischen Anwendungen führen

Ein Protein aus einem wärmeliebenden Bakterium ermöglicht den spezifischen Nachweis von SARS-CoV-2 und anderen Viren in einem Eintopf-Assay auf Basis der RT-LAMP-Technologie. Dieser Test könnte die Point-of-Care-Diagnose von COVID-19 und anderen Infektionen vereinfachen.

RT-LAMP-Tests ähneln PCR-Tests: Sie erkennen winzige Mengen viralen genetischen Materials in einer Probe, indem sie es auf nachweisbare Mengen amplifizieren. Ein Vorteil eines RT-Tests gegenüber PCR-Tests besteht darin, dass er bei einer einzigen Temperatur (55–65 Grad Celsius) durchgeführt wird, anstatt wiederholt verschiedene Temperaturen zu durchlaufen. Dadurch ist es schneller und einfacher zu bedienen. Der Nachteil ist jedoch, dass es nicht so genau ist wie die PCR, da es zu falsch positiven Ergebnissen kommen kann.

„Wenn ein zusätzlicher Spezifitätsfaktor mit RT-LAMP gekoppelt werden könnte, um zwischen echter und falscher Amplifikation zu unterscheiden, könnte dies helfen, leistungsstarke Diagnosetechnologien zu entwickeln“, sagt Dr. KAUST. Schüler Ahmed Mahas.

Mahas und ein Team von Wissenschaftlern, die im Labor von Magdy Mahfouz arbeiten, wollten ein CRISPR-Cas-System finden, das mit RT-LAMP verwendet werden kann, um gezielt genetisches Zielmaterial in einem Eintopf-Assay nachzuweisen, ohne dass neue Reagenzien erforderlich sind. Cas-Proteine ​​sind die Verteidigungslinie von Bakterien gegen eindringende Krankheitserreger und wurden verwendet, um amplifizierte RNA nachzuweisen. Die meisten RNA-gerichteten Cas13-Proteine ​​funktionieren jedoch bei etwa 37 Grad Celsius, was mit RT-LAMP nicht kompatibel ist. Das Team wollte ein Cas13-Enzym finden, das auf virale RNA abzielt und bei den in RT-LAMP-Tests verwendeten Temperaturen stabil ist.

Beim Durchsuchen von Cas-Proteindatenbanken fanden sie einen vielversprechenden Kandidaten, der zu einem thermophilen (wärmeliebenden) Bakterium namens Herbinix hemicellulosilytica gehört. Eine weitere Suche in Proteindatenbanken identifizierte ein weiteres Cas-Protein mit einer ähnlichen genetischen Sequenz in einem Thermophilen namens Thermoclostridium caenicola. Tests zeigten, dass beide Cas-Proteine ​​bei relativ hohen Temperaturen stabil waren, aber das zu T. caenicola gehörende TccCas13a-Protein blieb in einem höheren Bereich (37–70 Grad Celsius) stabil.

Nach weiteren Tests und Optimierungen war das Team in der Lage, TccCas13a zu verwenden, um einen empfindlichen, robusten und schnellen Eintopf-Assay namens OPTIMA-dx zu entwickeln.

Der Test verwendet RT-LAMP, um die Anzahl der Zielvirus-RNAs in einer Probe zu amplifizieren. TccCas13a erkennt und schneidet es dann und aktiviert es, um auch spezielle fluoreszierend markierte RNAs zu schneiden, die der Mischung hinzugefügt werden. Dies erzeugt ein Fluoreszenzsignal, das von einer ebenfalls vom Team entwickelten mobilen Anwendung gelesen werden kann.

OPTIMA-dx wies erfolgreich SARS-CoV-2 in Patientenproben nach. Es wurde auch modifiziert, um andere Viren wie Hepatitis C oder sogar mehrere Viren gleichzeitig zu erkennen. Die Technologie wurde patentiert, ein Prototyp hergestellt und klinisch validiert, und das Team überführt das Produkt nun in eine Startphase mit dem Ziel der Massenproduktion und Kommerzialisierung.

„Die Suche nach dem thermostabilen TccCas13a-Enzym ist nur der Anfang“, sagt Mahfouz. „Wir untersuchen jetzt andere Systeme, um biologisch inspirierte disruptive Technologien für die Gesundheitsversorgung, Therapie und Diagnostik zu entwickeln.“

Die Forschung ist veröffentlicht in Proceedings of the National Academy of Sciences.

Erhöhen Sie die Hitze, um das Potenzial von Cas13 freizusetzen aus KAUST-Forschung an Vimeo.