High-Fidelity-Cas13-Varianten mit minimalem kollateralem RNA-Targeting

Eine kürzlich veröffentlichte Studie in Naturbiotechnologie offenbarten die Entwicklung von High-Fidelity-Cas13-Varianten mit deutlich reduzierten Nebenwirkungen durch Mutagenese und demonstrierten die Machbarkeit von hfCas13 für einen effizienten zielgerichteten RNA-Abbau fast ohne Begleitschäden in Säugetierzellen und Tieren.

Diese Arbeit wurde von Forschern im Labor von Dr. Yang Hui am Institute of Neuroscience, Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology der Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory of Neuroscience und dem F&E-Team von HuiGene Therapeutics Co., Ltd. durchgeführt.

Das CRISPR-Cas13-System ist ein hocheffizientes Werkzeug für programmierbares RNA-Targeting und wurde für den Nukleinsäurenachweis und RNA-Manipulationen in verschiedenen Zelltypen und Organismen genutzt. Es wurden jedoch Bedenken hinsichtlich der Off-Targeting-Effekte von Cas13 geäußert. Frühere Strukturstudien haben impliziert, dass bei der Bindung von Cas13 an die Ziel-RNA die beiden HEPN-Nukleasedomänen eine katalytische Stelle auf der Proteinoberfläche bilden könnten, die neben der zielgerichteten Spaltung von Ziel-RNAs ein Potenzial für die promiskuitive Spaltung von Bystander-RNAs bietet.

Aufgrund dieses sogenannten Kollateraleffekts könnte Cas13 sowohl Ziel- als auch Nicht-Ziel-RNAs willkürlich abbauen, was es schwierig macht, Experimente zu entwerfen und Ergebnisse bei der Verwendung von Cas13 zu interpretieren.

Daher sind für die Grundlagenforschung und zukünftige In-vivo-Anwendungen des Cas13-Systems Versuche erforderlich, den promiskuitiven RNA-Abbau durch technische Ansätze zu verringern oder zu eliminieren.

Die Forscher entwarfen ein Dual-Fluoreszenz-Reporter (EGFP & mCherry)-Plasmidsystem, um die Begleiterscheinungen von Cas13 in Säugetierzellen nachzuweisen. In diesem System wird der Verlust von mCherry-Fluoreszenzzellen als erfolgreiches On-Target-Editing interpretiert; Der Verlust von EGFP-fluoreszierenden Zellen wird als Off-Target-Spaltung angesehen. Die Ergebnisse zeigten, dass entweder Cas13a oder Cas13d signifikante Nebenwirkungen hervorrufen könnten.

Dann versuchten die Forscher, Cas13d (RfxCas13d oder CasRx, Cas13d aus Ruminococcus flavefaciens XPD3002) durch Mutagenese zu manipulieren und nach Varianten mit minimalen Nebenwirkungen zu screenen, basierend auf einem neuen, gut konzipierten Dual-Fluoreszenz-Reportersystem, das aus einem einzigen Plasmid besteht, das EGFP, mCherry, enthält , und auf EGFP gerichtete gRNA, zusammen mit jeder Cas13-Variante.

Yangs Team entwarf und erzeugte eine Mutagenesebibliothek von Cas13d-Varianten und transfizierte sie einzeln in HEK293-Zellen. Bei der Analyse der Reporterfluoreszenz mittels Durchflusszytometrie zeigten fünf Varianten (N1V7, N2V7, N2V8, N3V7 und N15V4) einen relativ geringen Prozentsatz an EGFP+-Zellen, aber einen hohen Prozentsatz an mCherry+-Zellen, was auf eine hohe Zielaktivität mit reduzierter Kollateralaktivität hinweist.

Die Variante N2V8, die aufgrund ihrer höchsten Spezifität für den RNA-Abbau als High-Fidelity-Cas13d (hfCas13d) bezeichnet wird, wurde zur weiteren Charakterisierung verwendet, einschließlich einer transkriptomweiten Off-Target-Analyse unter Verwendung von RNA-Sequenzierung. Das hfCas13d zeigte eine deutliche Verringerung der Anzahl von Off-Target-Genen, wenn es auf mehrere endogene Transkripte wie PPIA abzielte. Darüber hinaus zeigten hfCas13-Varianten keine nachweisbaren Kollateralschäden in Zelllinien, transgenen Tieren und somatischen Zellen, was ihre In-vivo-Anwendungen unterstützt.

Wichtig ist, dass Yang und sein Team im Jahr 2021 das CRISPR-Cas13X-System identifizierten, das derzeit kleinste (nur 775 Aminosäuren) RNA-Bearbeitungstool. In ihrer neuen Studie entwickelten die Forscher Cas13X weiter und erhielten eine hfCas13X-Variante, die eine hohe Spezifität des zielgerichteten RNA-Abbaus, aber minimale Kollateraleffekte aufweist. hfCas13X wird ein großes Anwendungspotenzial im Bereich der Gentherapie basierend auf RNA-Editierung zeigen.

Diese Arbeit wurde online veröffentlicht in Naturbiotechnologie am 11.08.2022. Tong Huawei, Huang Jia, Xiao Qingquan, He Bingbing, Dong Xue und Liu Yuanhua sind Co-Erstautoren mit gleichen Beiträgen.