Hellere Fluoreszenzmarker ermöglichen eine feinere Abbildung

Forscher der McKelvey School of Engineering an der Washington University in St. Louis haben eine neue Technik entwickelt, die eine hochauflösendere Abbildung sehr kleiner Objekte wie Neuronen ermöglichen wird. Die Technik, die eine bestehende Methode namens Expansionsmikroskopie verbessert, wird in einem neuen Artikel beschrieben, der in der Zeitschrift veröffentlicht wurde Nano-Buchstaben.

Die meisten Menschen sind mit Mikroskopen vertraut, die mithilfe von Linsen ein Objekt größer erscheinen lassen und es für das menschliche Auge besser erkennbar machen. Aber die Expansionsmikroskopie (ExM) funktioniert praktisch umgekehrt – indem sie das Objekt selbst größer macht. Wissenschaftler beschichten die Probe – zum Beispiel eine Zelle – mit winzigen lichtemittierenden Markern, sogenannten Fluorophoren, und betten die Probe dann in ein Gel ein, das sich ausdehnt, wenn es mit Wasser in Kontakt kommt. Wenn die Probe größer wird, zeichnen die fluoreszierenden Markierungen die Umrisse von Merkmalen nach, die zu klein sind, um sie zu sehen, wie etwa die dünnen Zweige oder Dendriten, die aus Gehirnzellen wachsen.

Doch die Expansionsmikroskopie weist einen großen Mangel auf. Das von herkömmlichen Fluorophoren emittierte Lichtsignal verliert während der Vorbereitungs- und Expansionsschritte einen Großteil seiner Intensität (mehr als 50 %).

„Wenn man Dinge größer macht, ist das nicht unbedingt gut, denn wenn man die Menge des bereits vorhandenen Signals nicht ändert, wird dieses Signal schwächer“, sagte Barani Raman, Professor für Biomedizintechnik.

Raman und Srikanth Singamaneni, Lilyan & E. Lisle Hughes-Professor in der Abteilung für Maschinenbau und Materialwissenschaften, haben dieses Problem durch den Einsatz ultraheller fluoreszierender Marker namens Plasmonische Fluore (PFs) angegangen. Singamaneni hat die PFs im Jahr 2020 für andere Anwendungen entwickelt.

„Es ist ein schönes Beispiel dafür, wie zwei Menschen mit völlig unterschiedlichen Fachkenntnissen ein zufälliges Gespräch führen und sagen: „Okay, dieses Problem liegt hier in einem Bereich, aber die Lösung gibt es in einem anderen Bereich“, sagte Raman. Das Team hat seine neue Technik „plasmonenverstärkte Expansionsmikroskopie“ oder p-ExM getauft.

Das plasmonische Fluor besteht aus einem Kernteilchen aus Gold, das in eine Silberhülle eingewickelt ist und dann mit einer Schicht aus anderen Materialien, einschließlich herkömmlicher Fluorophore, bedeckt wird. Die Struktur soll die Fluorophore vor den aggressiven Chemikalien schützen, die im Prozess verwendet werden, und das Lichtsignal der Fluorophore deutlich heller machen. Die Technik wird Forschern bei der Kartierung neuronaler Netze oder der Verbindungen zwischen Neuronen helfen.

„Das Metall-Nanopartikel dient als Antenne, was bedeutet, dass es mehr Licht in die Fluorophore ziehen kann“, sagte Singamaneni. Die Wechselwirkung zwischen dem Gold-Silber-Nanopartikel und den Fluorophoren führt außerdem dazu, dass die Fluorophore mehr Photonen aussenden, als sie es normalerweise tun würden. Dadurch ist das plasmonische Fluor fast vier Größenordnungen heller, als die Fluoreszenzmarker allein wären. Plasmonische Fluoreszenzmittel lösen auch das Problem der Signalverdünnung, da die Fluoreszenzmarker direkt an den Nanopartikeln befestigt sind und sich daher nicht ausbreiten, wenn sich die Probe ausdehnt.

Um das Potenzial der plasmonenverstärkten Expansionsmikroskopie zu demonstrieren, untersuchten die Forscher damit eine Probe von Neuronen aus der Hippocampus-Region des Gehirns. In manchen Fällen liegen die neu entstehenden Äste des Neurons, sogenannte Neuriten, zu nahe beieinander, als dass sie ohne die Hilfe von Techniken wie der Expansionsmikroskopie erkennbar wären.

„Wenn zwei Neuriten zu nahe beieinander liegen, können wir sie nicht auflösen. Die Software geht davon aus, dass es sich nur um einen Neuriten handelt“, sagte Singamaneni.

Nachdem die Zellen mit den ultrahellen plasmonischen Fluoreszenzmitteln markiert und die Probe vergrößert worden waren, konnte das Team die Anzahl der Neuriten zählen, die Gesamtfläche der Neuriten quantifizieren und die Länge einzelner Neuriten messen. Sie identifizierten 2,5-mal mehr Neuriten-Endpunkte, als vor der Erweiterung der Probe sichtbar waren.

Als das Team die Leistung des Plasmonischen Fluors mit der der Fluorophore selbst verglich, stellte es fest, dass das Plasmonische Fluor etwa 76 % des Lichtsignals behielt, während die Fluorophore weniger als 16 % behielten. Die Ergebnisse des Teams zeigten auch, dass die plasmonenverstärkte Expansionsmikroskopie mit bestehenden Expansionsmikroskopieprotokollen kompatibel ist, was bedeutet, dass in zukünftigen Studien plasmonische Fluore anstelle herkömmlicher Fluorophore verwendet werden können. PFs können auch aus jedem beliebigen Fluorophor erstellt werden, das den Anforderungen der Forscher entspricht.