Glycerol kann funktionelle Assays gefährden und die Erfolgsaussichten bei Kampagnen zur Entwicklung von Arzneimitteln verringern

Neue Antituberkulose-Medikamente sind aufgrund der Ausbreitung resistenter Stämme von Mycobacterium tuberculosis von entscheidender Bedeutung. Ein Forschungsteam von Skoltech, MIPT und dem Institut für Bioorganische Chemie der Nationalen Akademie der Wissenschaften von Belarus (IBOCH NAS) hat ultrahochaufgelöste Strukturen des Cytochroms von M. tuberculosis im Komplex mit einem Inhibitor erhalten. Die Ergebnisse des Teams zeigen, dass Glycerin – ein weit verbreiteter Zusatzstoff für Proteinlösungen – strukturelle und funktionelle Studien beeinträchtigen und die Arzneimittelentwicklung behindern kann. Die Studie wurde veröffentlicht in Acta Crystallographica Abschnitt D Strukturbiologie.

Da Tuberkulose weiterhin eine der tödlichsten Krankheiten des Menschen ist und die Zahl arzneimittelresistenter Stämme jedes Jahr zunimmt, wird die Entwicklung neuer Behandlungen zu einer zwingenden Herausforderung für Wissenschaftler weltweit.

Einer Hypothese zufolge sind die P450-Cytochrome an der Arzneimittelresistenz beteiligt. Die Funktionen der meisten Enzyme dieser Familie sind jedoch noch unbekannt. Ähnliche Cytochrome gibt es auch beim Menschen, und der Arzneimittelstoffwechsel ist eine ihrer Aktivitäten. M. tuberculosis infiziert menschliche Zellen und schafft es, sich wie ein Spion vor dem Immunsystem in Makrophagen zu verstecken. Für das Bakterium ist die Funktion einiger Cytochrome der entscheidende Überlebensfaktor, der seine Fähigkeit bestimmt, der Immunantwort zu entgehen.

Für Arzneimittelentwickler ist es wichtig zu verstehen, wie Cytochrome funktionieren. In verschiedenen Assays im Labor – von der Proteinisolierung bis hin zu Strukturstudien – verwenden Wissenschaftler Glycerin, um das Protein während des Experiments stabiler zu machen. Das Team stellte in Frage, ob Glycerin die enzymatische Aktivität beeinflussen könnte.

Valentin Borshchevskiy, stellvertretender Direktor des MIPT-Forschungszentrums für molekulare Mechanismen des Alterns und altersbedingter Krankheiten, erklärt: „Zuvor hatten wir die kristallographische Struktur von CYP124 aufgeklärt, einem der Cytochrome der Tuberkulose, das mit dem CHImi-Inhibitor komplexiert ist, der als Prototyp dient für neue Anti-Tuberkulose-Medikamente. Wir fanden Glycerinmoleküle in der Struktur. Um ihre Wirkung auf das Enzym zu verstehen, bestimmten wir die Struktur unter den gleichen Bedingungen, aber ohne Glycerin. Die resultierende Struktur mit ultrahoher Auflösung zeigte, dass der Ligand eine andere Orientierung hat und mehrere Konformationen.“

Um zu überprüfen, wie sich Glycerin auf die Ligandenbindung auswirkt, führten die Forscher Funktionstests auf Basis spektrophotometrischer Titration durch. Die P450-Cytochrome enthalten eine prothetische Hämgruppe mit Eisen, die für ihre rote Farbe und ihr ausgeprägtes Absorptionsspektrum nahe ~450 nm verantwortlich ist (daher ihr Name P450). Die Bindung kleiner Moleküle beeinflusst das Absorptionsspektrum – eine Änderung, die von einem Spektrophotometer registriert werden kann. Die während Gleichgewichtstitrationen von P450 mit Inhibitor beobachteten Extinktionsänderungen, aufgetragen gegen die Konzentration, erlauben die Berechnung der Dissoziationskonstante, einem physikalisch-chemischen Wert für die Bindungsspezifität. Die Studie zeigte eine zehnfache Abnahme der Affinität im glycerolhaltigen Puffer.

Natallia Strushkevich, Assistenzprofessorin bei Skoltech Bio, kommentiert: „Wir hatten das Glück, qualitativ hochwertige Kristalle für die Atomanalyse zu erhalten und zu bestätigen, dass die Zugabe von Glycerin zur Lösung die Fähigkeit von Cytochrom beeinträchtigt, Inhibitoren zu binden, was ein Problem für die Arzneimittelentwicklung darstellen kann .“

Die Studie zeigte, dass Glycerin – eine allgegenwärtige Komponente in allen biophysikalischen Strukturstudien – experimentelle Ergebnisse direkt beeinflusst, zu Fehlinterpretationen und irreführenden Forschern führt und somit das Arzneimitteldesign gefährdet. Es lohnt sich, die Auswirkungen zusätzlicher Faktoren wie Glycerin zu berücksichtigen und das Experiment sorgfältig zu planen.