Genomweiter Atlas der Zellmorphologie enthüllt Genfunktionen

Die Visualisierung von Zellen nach der Bearbeitung bestimmter Gene kann Wissenschaftlern dabei helfen, neue Details über die Funktion dieser Gene zu erfahren. Doch die Verwendung von Mikroskopie in großem Maßstab kann eine Herausforderung darstellen, insbesondere wenn Tausende von Genen gleichzeitig untersucht werden.

Jetzt haben Forscher des Broad Institute of MIT und Harvard zusammen mit Mitarbeitern von Calico Life Sciences einen Ansatz entwickelt, der die Leistungsfähigkeit der Mikroskopie-Bildgebung auf skalierbare Weise auf CRISPR-Screenings im Genommaßstab überträgt.

PERISCOPE – was für Perturbation Effect Readout in situ via Single-Cell Optical Phänotyping steht – kombiniert zwei von Broad-Wissenschaftlern entwickelte Technologien: Cell Painting, das Bilder und Schlüsselmaße subzellulärer Kompartimente im großen Maßstab erfassen kann, und Optical Pooled Screening, das „Barcodes“ erstellt. Zellen und nutzt CRISPR, um einzelne Gene systematisch auszuschalten, um ihre Funktion in diesen Zellen zu untersuchen.

Mit der neuen Technik können Wissenschaftler die Auswirkungen der Störung von über 20.000 Genen auf Hunderte von bildbasierten Zellmerkmalen untersuchen. Die Generierung von Daten mit dieser Methode ist mehr als zehnmal kostengünstiger als vergleichbare hochdimensionale Ansätze wie die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung und kann für die Untersuchung einer Vielzahl von Zelltypen angepasst werden.

In ihrem Artikel veröffentlicht In Naturmethodenverwendeten die Forscher PERISCOPE, um drei CRISPR-Screenings des gesamten Genoms durchzuführen und einen Open-Source-Atlas der Zellmorphologie zu erstellen.

Die Studie ist das Ergebnis einer Zusammenarbeit zwischen den Labors der Broad-Co-Senior-Autoren JT Neal, Institutswissenschaftler und Co-Direktor für Typ-2-Diabetes-Systemgenomik; Anne Carpenter, Institutswissenschaftlerin und leitende Direktorin der Imaging Platform; und Paul Blainey, Mitglied des Kerninstituts; sowie Calico unter der Leitung von Co-Senior-Autor Calvin Jan. Die Broad-Stab-Wissenschaftler Meraj Ramezani und Erin Weisbart, die wissenschaftliche Mitarbeiterin Julia Bauman und der Postdoktorand Avtar Singh waren allesamt Co-Erstautoren der Studie.

„Dieser Atlas selbst ist eine erstklassige Ressource im Genommaßstab, die die Zellmorphologie mit der Genfunktion verknüpft, und ich denke, er hat großes Entdeckungspotenzial“, sagte Neal. „Aber vielleicht noch wichtiger ist, dass alle Daten offen zugänglich sind und wir wirklich robuste Analyse-Pipelines in Industriequalität aufgebaut haben, die von jedem für die Analyse optisch gepoolter Screening-Daten in großem Maßstab genutzt werden können.“

Morphologische Erkenntnisse

Cell Painting wurde erstmals 2013 von Carpenter entwickelt und ist ein Assay, mit dem mehrere Zellorganellen gleichzeitig und maßstabsgetreu abgebildet und in verschiedenen Farben wie Kernblau und Mitochondrienrot „gemalt“ werden können. Modelle für maschinelles Lernen erkennen dann Hunderte subtiler Veränderungen in den Bildern, etwa die Textur des Zytoplasmas oder den Bereich des Zellkerns, sodass Forscher beispielsweise die Auswirkungen einer Genstörung auf die Zelle testen können.

Als Neal 2017 als Forscher im Krebsprogramm zu Broad kam, war er von der Möglichkeit fasziniert, Cell Painting auf Krebszellen anzuwenden, um die Funktion von Schlüsselgenen und -varianten zu erlernen, was bei der Entwicklung gezielter Therapien helfen könnte. Er begann ein Gespräch mit Carpenter und auch mit Blainey, dessen Labor die optische gepoolte Abschirmung entwickelt hatte.

Die drei begannen zu diskutieren, wie sie die beiden Techniken kombinieren könnten, und begannen 2019 in Zusammenarbeit mit Calico mit dem Aufbau von PERISCOPE, einschließlich einer zugehörigen Rechenpipeline, die in Cell Profiler integriert ist.

In PERISCOPE führen die Forscher eine Bibliothek von Leit-RNAs ein, die auf etwa 20.000 Gene in Zellen abzielen. Als nächstes induzieren sie die Expression des DNA-schneidenden Cas9-Enzyms, um die Gene, auf die die Guides abzielen, zu deaktivieren.

Anschließend wandeln sie die Leit-RNAs in komplementäre DNA um und erstellen so „Barcodes“ des in jeder Zelle ausgeschalteten Gens, anhand derer Wissenschaftler identifizieren können, welches Gen in jeder Zelle ausgeschaltet wurde. Dieser Barcode ermöglicht auch die Untersuchung vieler Gene in einer einzigen Zellcharge, was effizienter ist, als sie einzeln zu testen.

Schließlich verwenden sie ein Standard-Weitfeldmikroskop, um Bilder der fünf Cell Painting-Färbungen und der vierfarbigen Barcodes in den Zellen aufzunehmen, gefolgt von einer automatisierten Bildanalyse, um Zellmerkmale zu extrahieren und sie mit Leit-RNAs zu verknüpfen.

Mithilfe von PERISCOPE erstellten die Forscher Atlanten über die Auswirkungen des Ausschaltens von Genen in menschlichen Lungen- und Gebärmutterhalskrebszellen in Standard-Zellkulturmedien sowie in Medien, die der physiologischen Umgebung stärker ähneln.

Diese Atlanten veranschaulichten nicht nur bekannte Biologie, sondern enthüllten auch neue Informationen über schlecht charakterisierte Gene. Sie deckten beispielsweise die Funktion von TMEM251 auf, einem Gen, das mit einer seltenen genetisch bedingten lysosomalen Speicherkrankheit in Verbindung gebracht wird. Das Team fand heraus, dass es für den Transport von Enzymen zu Lysosomen erforderlich ist.

Als nächstes arbeitet das Team daran, die Fähigkeit aufzubauen, noch mehr Farben gleichzeitig abzubilden und so die Palette der Merkmale zu erweitern, die PERISCOPE erfassen kann. Sie arbeiten außerdem mit Forschern des Novo Nordisk Foundation Center for Genomic Mechanisms of Disease von Broad zusammen, um Störungsatlanten in kardiometabolischen Zelltypen zu erstellen, und mit Broads Ladders to Cures Accelerator, um Behandlungen für seltene genetische Störungen zu identifizieren.

Darüber hinaus geht das Team davon aus, dass PERISCOPE bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit anwendbar sein wird. Neal sagt, dass PERISCOPE eines Tages sogar Studien über die Wechselwirkungen zwischen mehreren Genen ermöglichen könnte.

„In der Vergangenheit war das schwierig, weil der Raum der genetischen Interaktion sehr schnell skaliert“, sagte er. „Mit PERISCOPE und anderen skalierbaren optischen Pool-Screening-Ansätzen ist es nun nicht mehr weit hergeholt, sich sehr große genetische Interaktionsscreenings vorzustellen.“