Generierung von Antimykotika durch bakterielle Konjugation an Hefe

Die vielfältigen Pilze spielen in unserem täglichen Leben gleich mehrere Schlüsselrollen. Von der Erleichterung des ökologischen Nährstoffkreislaufs über die Verwendung in der industriellen Fertigung bis hin zu einer Schlüsselzutat in unserer Nahrung tragen Pilze viele verschiedene Hüte. Unter allen Pilzarten sind Hefen die am besten untersuchten und am leichtesten vom Menschen zu zähmen.

Beispielsweise wird die Hefeart Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) nicht nur als primärer Fermenter für Bier, Brot und Wein verwendet, sondern ist auch eine entscheidende Komponente bei der Produktion von Insulin, Impfstoffen und essentiellen rekombinanten Proteinen. Aber nicht alle Hefen und Pilze sind menschenfreundlich und zähmbar. Mehrere Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die mit leichten bis schweren Pilzinfektionen und sogar Krebs in Verbindung gebracht werden.

Plasmide sind kleine genetische Strukturen, die unabhängig von den Chromosomen sind und sich selbst replizieren können. Sie können verwendet werden, um synthetische, modifizierte Gene in die Zellen anderer Organismen einzubringen. Die Plasmidabgabe durch Konjugation zwischen Bakterienarten hat sich bei der Entwicklung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe als wirksam erwiesen, die auf spezifische Gene abzielen, um Krankheitserreger zu eliminieren oder zu unterdrücken.

Dieser Ansatz hat sich Wissenschaftlern jedoch entzogen, wenn es um den Umgang mit Hefen geht, die weniger kontrollierbar sind. Daher ist es unerlässlich geworden, die Biologie von Pilzarten für kritische biotechnologische Anwendungen, insbesondere die Entwicklung von Antimykotika, zu untersuchen und zu manipulieren.

Als Reaktion auf diese unerfüllte Anforderung hat ein Forscherteam aus Kanada die Übertragung überlegener konjugativer Plasmide zwischen Bakterien und verschiedenen Hefearten durch Konjugation entwickelt und optimiert.

„Um unsere neuartigen Plasmide herzustellen, haben wir Derivate des konjugativen Plasmids pTA-Mob 2.0 gebaut, indem wir gezielte Gendeletionen und Clustermutationen verwendet haben, um die bakterielle Konjugation mit Hefen zu verbessern“, erklärte Dr. Bogumil J. Karas, Assistenzprofessor an der University of Western Ontario und korrespondierender Autor der Studie, die in veröffentlicht wurde BioDesign-Forschung.

pTA-Mob 2.0 besteht aus genetischen Elementen, die für die Erhaltung und Übertragung von Plasmiden erforderlich sind, wodurch es sich ideal für diese Studie eignet. Das Team optimierte dieses Plasmid zunächst für die Bakterien-an-Hefe-Konjugation, indem es 55 Gene oder kleine genetische Regionen löschte, um vier stromlinienförmige Plasmide zu erstellen: M1–M4, mit jeweils zwei Klonen. Diese modifizierten Plasmide wurden dann von Escherichia coli (E. coli)-Bakterien durch Konjugation auf S. cerevisiae übertragen und basierend auf der Bildung von Hefekolonien bewertet.

Plasmid M3 Klon 1 (M3C1) zeigte die signifikanteste Steigerung der Konjugationseffizienz. Es wurde festgestellt, dass die Mutationen, die zu dieser erhöhten Effizienz beitrugen, in der Promotorregion des konjugativen Gens traJ liegen. Diese Mutation senkte die Expression von traJ, was die Expression anderer konjugativer Proteine ​​signifikant beeinflusste und dadurch die Konjugation förderte.

Danach wurden fünf abgeleitete Plasmide von M3C1 erstellt, die die traJ-Mutation enthielten, einschließlich des Plasmids pSuperCon5 (pSC5) mit zusätzlichen Elementen für einen verbesserten konjugativen Transfer auf verschiedene Hefespezies und Diatomeen. pSC5 wurden auch Antibiotika-Selektionsmarker hinzugefügt.

Im Vergleich zum ursprünglichen pTA-Mob 2.0-Plasmid war die Bakterien-Hefe-Konjugationsfrequenz für pSC5 10- und 23-mal höher, wenn es in cis- (das sich selbst mobilisiert) bzw. trans- (das ein anderes Plasmid mobilisiert) Anordnungen getestet wurde. Dies könnte daran liegen, dass die Bakterien weniger nachteilige Auswirkungen auf die Hefe hatten, wenn sie das pSC5-Plasmid trugen.

Diese verstärkte Konjugation wurde mit einer anderen Bakterienart – Sinorhizobium meliloti als pSC5-tragendem Donor – weiter repliziert, was darauf hindeutet, dass dieser Mechanismus mit verschiedenen Bakterien verwendet werden kann. Darüber hinaus ermöglichte das pSC5-Plasmid einen erfolgreichen DNA-Transfer auf sieben Hefearten, darunter Candida auris – ein bekanntes Pathogen – wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz.

Anschließend wurde das pSC5-Plasmid für die Golden-Gate-Assemblierung domestiziert – eine molekulare Klonierungsmethode, die den gleichzeitigen und gerichteten Zusammenbau mehrerer wünschenswerter DNA-Fragmente zu einem einzigen Stück ermöglicht. Anschließend verifizierten und bewiesen die Forscher, dass ihre neuartige Bakterien-an-Hefe-Konjugationsmethode und verbesserte konjugative Plasmide verwendet werden können, um antimykotische Therapien mit hoher Effizienz bereitzustellen.

Das Team erwägt nun die Integration seines konjugationsübergreifenden Konjugationssystems mit CRISPR-basierten genetischen Bearbeitungsplattformen, um pathogene Pilze in verschiedenen Umweltnischen anzugreifen.

Über den Erfolg und zukünftige Anwendungen dieser Forschung sagte Dr. Karas: „Konjugationsbasierte Techniken wie die von uns entwickelte bieten eine einzigartige und funktionelle Methode, um Plasmide zwischen mikrobiellen Arten in vitro und in vivo zu transportieren. Mit zusätzlichen Verbesserungen in der Konjugationsfrequenz könnten unsere konjugativen Designer-Plasmide als antimykotische Reagenzien mit wichtigen Anwendungen für die Entwicklung von antimikrobiellen Arzneimitteln der nächsten Generation verwendet werden.“