Genetische Informationen, die in genomischer DNA kodiert sind, werden in mRNAs transkribiert und dann werden die Codons auf der mRNA durch Transfer-RNAs (tRNAs) während der Proteinsynthese dekodiert. tRNAs liefern Aminosäuren an Ribosomen und Proteine werden gemäß der entschlüsselten genetischen Information aus den Aminosäuren auf den Ribosomen synthetisiert. Daher spielt tRNA eine Schlüsselrolle bei der Übersetzung genetischer Informationen.
tRNAs enthalten zahlreiche modifizierte Nukleoside, die die Genauigkeit und Effizienz der Proteinsynthese regulieren. Modifizierte Nukleoside in tRNA werden durch tRNA-Modifikationsenzyme synthetisiert. Enthüllung der Mechanismen, durch die tRNA-Modifikationsenzyme selektiv Substrat-tRNAs von Nicht-Substrat-RNAs erkennen; Wann, wo und wie viele tRNAs durch die Modifikationsenzyme modifiziert werden, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Proteinsynthesemaschinerie.
Die Beantwortung dieser Schlüsselfragen ist jedoch aufgrund des Fehlens einer Hochdurchsatztechnik, die die charakteristischen Eigenschaften von tRNA-Modifikationsenzymen identifiziert, eine Herausforderung.
Um dieses Problem zu lösen, haben Dr. Yamagami und Hori von der Ehime University wendeten die DNA-Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation auf Funktionsanalysen von tRNA-Modifikationsenzymen an und entwickelten eine neue Hochdurchsatz-Assay-Methode, „tRNA-MaP“.
Die tRNA-MaP-Technik kann einen RNA-Pool, der aus mehr als 5.000 RNA-Spezies besteht, schnell durchmustern und die Substrat-tRNAs der Ziel-tRNA-Modifikationsenzyme mit vergleichbarer Empfindlichkeit zu bereits etablierten Methoden identifizieren. Mittels tRNA-MaP in Kombination mit Proteinorthologie-Analysen sagten die Forscher zahlreiche natürliche Modifikationen in Geobacillus stearothermophilus-tRNAs voraus.
Darüber hinaus analysierten sie mithilfe von tRNA-Map den Substraterkennungsmechanismus der G. stearothermophilus tRNA m1A22 Methyltransferase (TrmK), die Adenosin an Position 22 zu 1-Methyladenosin (m1A22) in tRNA methyliert. Mutationsprofile haben gezeigt, dass TrmK eine Untergruppe von tRNAs für das Substrat auswählt.
Unter Verwendung von 240 Varianten von G. stearothermophilus tRNALeu-Transkripten fanden die Forscher heraus, dass U8, A14, G15, G18, G19, U55, Purine57 und A58 wichtig für die Methylierung durch TrmK sind. Darüber hinaus wurde basierend auf den Erkennungsstellen in tRNA und der Kristallstruktur von TrmK ein Docking-Modell zwischen TrmK und tRNA konstruiert.
Diese Studie, jetzt veröffentlicht in der Zeitschrift für Biologische Chemie, zeigten, dass tRNA-Map für die Analyse des tRNA-Modifikationsenzyms anwendbar ist. Da tRNA-Map jede molekulare RNA-Spezies aus jedem Organismus analysieren kann, sogar DNA-Moleküle, kann tRNA-Map für die Analyse aller nukleinsäureverwandten Proteine mit Ausnahme von tRNA-Modifikationsenzymen verwendet werden. Somit kann tRNA-Map das integrative Verständnis des Flusses genetischer Information beschleunigen.
Mehr Informationen:
Ryota Yamagami et al., Anwendung von Mutationsprofilen: Neue Funktionsanalysen enthüllen den tRNA-Erkennungsmechanismus der tRNA-m1A22-Methyltransferase, Zeitschrift für Biologische Chemie (2022). DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102759
Bereitgestellt von der Ehime University