Nanoskopie beschreibt die Fähigkeit, über die allgemein akzeptierte optische Grenze von 200–300 nm hinaus zu sehen. Die Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopie, 1994 von Stefan W. Hell und Jan Wichmann entwickelt und 1999 von Hell und Thomas Klar experimentell demonstriert, ist eine superauflösende Technik für die Nanoskopie. Die STED-Mikroskopie hat erhebliche Fortschritte gemacht und ist in der praktischen Forschung weit verbreitet. Aber seine praktische Verwendung bringt ein unerwünschtes Hintergrundrauschen mit sich, das die räumliche Auflösung und die Bildqualität negativ beeinflusst. Im Allgemeinen kommt dieses Rauschen von zwei Signalquellen: (i) Fluoreszenz, die durch Wiederanregung erzeugt wird, die durch ultrahohe Lichtdosen aus dem Verarmungsstrahl verursacht wird; und (ii) Restfluoreszenz aufgrund unzureichender Verarmung des Hemmstrahls.
In den letzten Jahrzehnten wurden bedeutende Ansätze zur Hintergrundentfernung entwickelt. Diese können in drei Kategorien unterteilt werden: Zeitbereich, Raumbereich und Zeigerbereich. Einige dieser Methoden sind altbewährt, andere erst kürzlich entwickelt worden. Obwohl es leistungsstarke Möglichkeiten gibt, unerwünschtes Rauschen aus STED-Mikroskopiebildern zu entfernen, bringen sie alle Nachteile mit sich, darunter Bildverzerrung, verlängerte Aufnahmezeiten oder die Einführung von Schrotrauschen. Die STED-Mikroskopie hat ihr volles Potenzial noch nicht ausgeschöpft.
Wie in berichtet Fortgeschrittene Photonikhaben Forscher der Zhejiang University kürzlich eine neuartige Methode namens „Dual-Modulation Difference“ STED (dmdSTED) entwickelt, um Hintergründe selektiv und effektiv zu unterdrücken. Das Verfahren arbeitet durch Sortieren von Raumdomänensignalen in die Frequenzdomäne, so dass die nicht abgereicherte Fluoreszenz und der STED-induzierte Hintergrund bequem von den gewünschten Fluoreszenzsignalen getrennt werden. Der Anregungs- und der Verarmungsstrahl werden jeweils mit unterschiedlichen Zeitbereichsmodulationen belastet. Da die durch den Verarmungsstrahl verursachte erneute Anregung vermieden wird, kann ein Verarmungslaser mit einer Wellenlänge ausgewählt werden, die näher an der Spitze des Fluoreszenzemissionsspektrums der Probe liegt, wodurch die erforderliche Verarmungsintensität verringert wird.
Die aktuelle Version von dmdSTED arbeitet mit einer räumlichen Auflösung von λ/8, eine höhere Auflösung als die Phasor-Domain-Methoden (z. B. SPLIT, λ/5), die anfällig für Schrotrauschen sind. Theoretisch kann durch diesen Ansatz ein potenzieller Signalverlust durch Time-Domain-Ansätze (wie Time-Gating) vermieden werden. Darüber hinaus ist dmdSTED sowohl mit gepulsten als auch mit Dauerstrichszenarien kompatibel, und es ist keine Hardware für die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) erforderlich. Im Vergleich zu Raumbereichsverfahren ist die Zeitauflösung von dmdSTED nicht eingeschränkt. Somit ist dmdSTED vorteilhaft bei der Erfassung umfassend feiner Mikroskopiebilder, in räumlicher Auflösung, SNR und zeitlicher Auflösung.
Laut dem leitenden Autor Xu Liu, Direktor des State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, „besitzt diese Frequenzbereichsmethode ein großes Potenzial, um den Ladungszustand in andere Dual-Beam-Point-Scanning-Techniken wie die Sättigungsmikroskopie im angeregten Zustand (ESSat) zu integrieren Verarmungsmikroskopie (CSD), Grundzustandsverarmungsmikroskopie (GSD) usw. Darüber hinaus kann es mehr Arten von Proben mit spektralen Eigenschaften aufnehmen, die sich von den üblicherweise verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen in STED unterscheiden, wie etwa einige Quantenpunkte mit einem breiteren Anregungsspektrum. “
Wensheng Wang et al, Dual-Modulation-Differenz-stimulierte-Emissions-Verarmungs-Mikroskopie zur Unterdrückung des Hintergrundsignals, Fortgeschrittene Photonik (2022). DOI: 10.1117/1.AP.4.4.046001
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