Forscher steigern Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Raman-Mikroskopietechnik

Forscher haben einen markierungsfreien und nicht-invasiven Raman-Spektroskopie-Ansatz entwickelt, der mikroskopische Bilder von biologischen Proben aufnehmen und eine breite Palette von Biomolekülen mit beispielloser Geschwindigkeit und Empfindlichkeit identifizieren kann.

„Unsere Arbeit könnte zu einem nicht-invasiven, etikettenfreien und benutzerfreundlichen Gerät für den klinischen Einsatz führen“, sagte Forschungsteamleiter Dario Polli vom Politecnico di Milano in Italien. „Dieses innovative Mikroskop könnte in Verbindung mit auf Deep Learning basierenden Algorithmen die Krebsdiagnose schließlich einfacher und schneller machen, indem es die Visualisierung der chemischen Bestandteile menschlicher Gewebe und Zellen ermöglicht.“

Im Tagebuch Optik Expressbeschreiben die Forscher ihre neue Technik, die auf kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-Mikroskopie basiert. Die CARS-Mikroskopie erzeugt Bilder basierend auf den Schwingungssignaturen von Molekülen, indem sie die Wechselwirkung zwischen ultrakurzen Laserpulsen und biologischen Proben ausnutzt.

Der neue Ansatz bietet Zugang zu dem schwer zu erkennenden Bereich des Schwingungsspektrums, der als Fingerabdruckbereich bekannt ist und sich von 400 bis 1800 cm−1 erstreckt. Obwohl viele einzelne Verbindungen anhand ihrer Schwingungs-Fingerabdrücke in dieser Region identifiziert werden können, erzeugt sie tendenziell schwache Signale, die schwer zu erkennen sind.

„Häufig verwendete Techniken in den biomedizinischen Wissenschaften erfordern häufig eine Färbung, die nicht nur umständlich ist, sondern auch strukturelle und chemische Veränderungen einführen kann, die zu Artefakten oder Fehlern bei der Bildgebung und Datenverarbeitung führen können“, sagte Polli. „Da unser System zwischen vielen verschiedenen chemischen Spezies in biologischen Geweben ohne Markierung unterscheiden kann, könnte es für die Bildgebung lebender Zellen und die Analyse von Gewebebiopsien nützlich sein.“

Niedrigere Wiederholungsrate, schnellere Bildgebung

Diese neue Arbeit ist Teil des CRIMSON-Projekts, das darauf abzielt, ein schlüsselfertiges Bildgebungsgerät zu entwickeln, das Schwingungsspektroskopie für eine schnelle Zell- und Gewebeklassifizierung verwendet. Das Ziel des Projekts ist es, die Erforschung des zellulären Ursprungs von Krankheiten zu transformieren, um neue Ansätze zu ermöglichen, die personalisierte Therapien vorantreiben könnten.

Als entscheidenden Schritt in Richtung dieses Ziels entwickelten die Forscher ein CARS-Mikroskop basierend auf einem kommerziellen Laser, der ultrakurze Pulse mit einer Dauer von etwa 270 Femtosekunden im nahen Infrarot-Wellenlängenbereich erzeugt. Sie haben das Mikroskopiesystem so konzipiert, dass es Laserpulse mit einer Wiederholrate von 2 MHz verwendet, was viel niedriger ist als die 40 oder 80 MHz, die von den meisten anderen CARS-Systemen verwendet werden.

Diese niedrigere Wiederholungsrate verringert photothermische Schäden an der Probe, da sie eine Verzögerung von 0,5 Mikrosekunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen erzeugt. Es erzeugt auch eine höhere Impulsenergie und Spitzenintensität am Brennpunkt, was ein stärkeres CARS-Signal erzeugt und eine schnellere Erfassungsgeschwindigkeit ermöglicht.

„Der wichtigste Vorteil der niedrigeren Wiederholungsrate besteht darin, dass wir breitbandige, rotverschobene Stokes-Pulse erzeugen konnten, die den gesamten Fingerabdruck-Schwingungsbereich abdecken, indem wir Weißlicht-Superkontinuumserzeugung in einem massiven Kristall verwenden“, sagte Federico Vernuccio, Doktorand am Politecnico di Milano und Erstautor der Studie. „Im Vergleich zu anderen Methoden ist dieser Ansatz technisch einfacher, kompakter und robuster.“

Die Verwendung eines im Vergleich zu Standardaufbauten rotverschobenen Spektralbereichs bedeutet, dass höhere Laserintensitäten verwendet werden können, bevor Lichtschäden eintreten. Die Forscher entwickelten auch neue Algorithmen, die standardmäßige numerische Berechnungsansätze mit künstlicher Intelligenz kombinieren. Diese Algorithmen rufen weitere Informationen aus den erfassten Daten ab und wandeln sie in Bilder um, die eine einfache Unterscheidung verschiedener chemischer Spezies ermöglichen.

„Dank unserer Verbesserungen liefert das CARS-System qualitativ hochwertige Bilder mit einer hochmodernen Aufnahmegeschwindigkeit“, sagte Vernuccio. „Unser System hat eine Pixelverweilzeit von weniger als 1 Millisekunde, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen. Diese Geschwindigkeit wird durch die Aktualisierungsrate des Spektrometers begrenzt.“

Hochgeschwindigkeitsempfindlichkeit

Um ihr System zu testen, verwendeten die Forscher Referenzproben, um die mit dem neuen Mikroskop gewonnenen Spektren mit denen zu vergleichen, die mit einer hochmodernen, wenn auch langsameren Schwingungsspektroskopietechnik aufgenommen wurden. Die beiden Methoden zeigten eine hervorragende Übereinstimmung, was zeigt, dass das neue System Spektren bei sehr hohen Geschwindigkeiten mit guter spektraler Auflösung und chemischer Spezifität liefern kann.

Anschließend bestimmten die Forscher die Nachweisgrenze ihres Systems, indem sie CARS-Spektren einer Reihe von Dimethylsulfoxid-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen aufzeichneten. Das System war in der Lage, die chemische Konzentration mit der beispiellosen Empfindlichkeit von 14,1 mmol/Liter zu messen, was etwa der doppelten Empfindlichkeit anderer CARS-Systeme entspricht, die im Fingerabdruckbereich arbeiten.

Sie zeigten auch die Fähigkeit des Systems, verschiedene transparente Kunststoffkügelchen in Mikrometergröße anhand ihrer Schwingungssignatur zu unterscheiden und räumlich zu lokalisieren, und nahmen Messungen an biologischen Geweben vor, um zu demonstrieren, dass die Technik bei biologischen Proben funktioniert, ohne Schäden zu verursachen.

„Unser CARS-Mikroskop ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung mit chemischer Spezifität bei höheren Geschwindigkeiten, wodurch die Raman-Bildgebung lebender Zellen besser durchführbar wird“, sagte Polli. „Damit könnte unser System zum Beispiel dazu genutzt werden, die Wechselwirkungen von Krebszellen mit Immunzellen zu analysieren oder zu charakterisieren, wie sich eine Chemotherapie auf Zellen auswirkt.“

Die Forscher arbeiten nun daran, ihr System zu verbessern, indem sie einen noch breiteren Wellenlängenbereich von Stokes-Pulsen durch Erzeugung von Weißlicht-Superkontinuum erzeugen. Dies würde sowohl die Bildgebungsgeschwindigkeit als auch die Anzahl nachweisbarer chemischer Analyten verbessern. Sie arbeiten auch an der Kommerzialisierung, indem sie benutzerfreundliche Software, kompakte optische Quellen und Designs für einen kommerziellen Prototyp und ein Detektionssystem entwickeln.