Mikrobiom-Engineering steht an vorderster Front bei der Verbesserung der menschlichen Gesundheit und der landwirtschaftlichen Produktivität. Es zielt darauf ab, die Ökosystemfunktion durch Veränderung der Mikrobenzusammensetzung zu verbessern. Dies kann durch einen „Bottom-up“-Ansatz erreicht werden, der die Einführung von gentechnisch veränderten Mikroben in eine Gemeinschaft beinhaltet.
Resistenzen bestehender Arten behindern jedoch die Etablierung neuer Mitglieder. Stattdessen ist es besser, fremdes genetisches Material mit dem „Top-down“-Ansatz zu liefern, der einen horizontalen Gentransfer (HGT) zwischen Mikroben beinhaltet. Das primäre Ziel hier ist es, effiziente Systeme für die Verbreitung von gentechnisch veränderter DNA über eine komplexe mikrobielle Gemeinschaft zu schaffen.
HGT-Prozesse umfassen Konjugation, Transformation und Transduktion. Das 1969 entdeckte Konjugationssystem, das vom Plasmid (kleine, extrachromosomale DNA) RP4 (auch als RK2 bekannt) getragen wird, ist ein bewährtes Modell für die Übertragung von DNA sowohl in grampositiven als auch in negativen Bakterien. Darüber hinaus sind Wissenschaftler nun bereit, die Toolbox für das RP4-Plasmid-basierte Mikrobiom-Engineering auf ein breites Spektrum von Mikroorganismen auszudehnen.
Zu diesem Zweck hat ein Forschungsteam des Spanischen Nationalen Zentrums für Biotechnologie in Madrid das Plasmid RP4 wieder zusammengesetzt, um einen Vektor zu schaffen, der genetisch codierte Merkmale über verschiedene mikrobielle Gemeinschaften verbreiten kann.
Die Forscher modifizierten die funktionellen Komponenten von RP4, um „pMating“ zu schaffen, einen systematischen selbstübertragbaren Plasmidvektor. Die Studie wurde veröffentlicht in BioDesign-Forschung von einem Team unter der Leitung von Prof. Victor de Lorenzo und den Kollegen Tomás Aparicio, Jillian Silbert und Sherezade Cepeda. „Das Endergebnis unserer Forschung war ein Toolset, das für die Genabgabe und Zirkulation in natürlichen mikrobiellen Konsortien optimiert ist“, sagt Prof. Lorenzo.
Das Team richtete zunächst Paarungsexperimente ein, um die Leistung von pMATING in zwei verschiedenen gramnegativen Arten, Escherichia coli und Pseudomonas putida EM42, zu testen. Mit hohen Übertragungseffizienzen könnte pMating erfolgreich von E. coli zu P. putida und umgekehrt wechseln.
Vor diesem Hintergrund führten die Forscher zwei zusätzliche Konjugationstests durch, um DNA von E.coli auf das grampositive Bakterium Bacillus subtilis und die Hefe Saccharomyces cerevisiae zu übertragen. Sie waren erstaunt, als sie entdeckten, dass pMating DNA auf beide Empfänger übertragen konnte, was auf eine „Transkingdom-Konjugation“ von Bakterien zu Pilzen hinweist, ein Konzept, über das anderswo selten berichtet wurde.
Die Forscher untersuchten dann, ob sich ihr neu geschaffenes Plasmid auf verschiedene Bakterienarten ausbreiten könnte. Unabhängige mikrobielle Pools wurden aus Bodenproben isoliert, die an zwei verschiedenen Orten in Spanien entnommen wurden, und der pMating-Transfer wurde mithilfe eines grün fluoreszierenden Tags verfolgt. Bis auf wenige war die Mehrheit dieser Isolate in der Lage, die DNA erfolgreich zu erhalten.
Dieser Transfer wurde auch in einer natürlichen Bodenprobe außerhalb des Labors validiert, die mit P. putida-Spenderbakterien bedeckt war. Diese Ergebnisse scheinen ein Hauptproblem bezüglich der Anwendung von HGT auf Bakterien anzusprechen, die in der natürlichen Umgebung leben.
Während die Studie die meisten Fragen zum Vektortransfer zwischen Bakteriengemeinschaften beantwortet, ist die größte Unbekannte, ob Empfänger nach Erhalt des Plasmids zu Spendern werden. „Es stimmt, dass pMating es Bakterien ermöglicht, das Plasmid an andere Bakterien weiterzugeben. Dies ist jedoch nicht immer der Fall. Dies liegt nicht an der Unfähigkeit des Empfängers, fremde DNA zu akzeptieren. Vielmehr kann es vorkommen, dass einige Spender ihre DNA nur ungern abgeben zu anderen Arten“, erklärt Prof. Lorenzo.
Während frühere Studien über einen konjugativen Transfer zwischen verschiedenen Mikroorganismen berichteten, ist pMating das erste, das Gene über Umweltmikrobiome hinweg transportiert. Prof. Lorenzo schließt: „Mit seiner relativ geringen Größe und Benutzerfreundlichkeit kann pMating2 ein fantastisches Werkzeug für den Genfluss durch komplexe Bakteriengemeinschaften sein. Zukünftige Vektoren, die davon inspiriert sind, werden nützlich sein, um mikrobielle Zielnischen für medizinische, ökologische und industrielle Zwecke zu fördern Anwendungen.“
Mehr Informationen:
Tomás Aparicio et al, Propagation of recombinant Genes through Complex Microbiomes with Synthetic Mini-RP4 Plasmid Vectors, BioDesign-Forschung (2022). DOI: 10.34133/2022/9850305
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