Forscher sagen die Proteinplatzierung auf Rasterkraftmikroskop-Substraten voraus

Forscher der Universität Kanazawa Bericht In Grenzen der molekularen Biowissenschaften eine rechnerische Methode zur Vorhersage der Platzierung von Proteinen auf AFM-Substraten basierend auf elektrostatischen Wechselwirkungen

Die Beobachtung biomolekularer Strukturen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) und die direkte Visualisierung funktioneller Konformationsdynamik in Hochgeschwindigkeits-AFM-Experimenten (HS-AFM) haben das Verständnis biologischer Prozesse auf der Nanoskala erheblich vorangetrieben.

In Experimenten wird eine biologische Probe auf einer Trägeroberfläche (AFM-Substrat) abgelegt und mit einer Sondenspitze abgetastet, um die Molekülform und ihre dynamischen Änderungen zu erfassen. Die Beobachtung der Proteindynamik unter HS-AFM ist ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Immobilisierung der Struktur auf der Trägeroberfläche und der gleichzeitigen Verhinderung zu starker Störungen durch die Immobilisierung.

Der Prozess, eine biomolekulare Probe auf der Trägeroberfläche zu platzieren und ihre ordnungsgemäße Befestigung zu kontrollieren, ist gleich zu Beginn jeder AFM-Beobachtung eine Herausforderung. Durch die chemische Zusammensetzung des Puffers können Wechselwirkungen zwischen Probe und Substrat verändert werden. Solche Oberflächenmodifikationen sind oft entscheidend für erfolgreiche AFM-Beobachtungen von Proteinstrukturen und ihren funktionellen Bewegungen. Allerdings ist die molekulare Ausrichtung der Probe „a priori“ unbekannt und aufgrund der Einschränkungen in der räumlichen Auflösung von Bildern schwer aus einer „a posteriori“-Analyse abzuleiten.

Romain Amyot, Noriyuki Kodera und Holger Flechsig von der Universität Kanazawa haben nun ein physikalisches Modell entwickelt, um die Platzierung biomolekularer Strukturen auf AFM-Substraten basierend auf elektrostatischen Wechselwirkungen vorherzusagen. Die Methode berücksichtigt die üblicherweise in AFM-Experimenten verwendeten Substrate (Glimmer, APTES-Glimmer, Lipiddoppelschichten) und berücksichtigt Pufferbedingungen.

In Computersimulationen wird eine große Anzahl möglicher molekularer Anordnungen auf dem AFM-Substrat untersucht und aus der Auswertung der entsprechenden Wechselwirkungsenergien die günstigste Platzierung ermittelt. Darüber hinaus ermöglicht die Analyse Vorhersagen zur Bildstabilität beim Spitzenscannen.

Die Autoren stellen mehrere Anwendungen der neuen Methode vor und erzielen eine bemerkenswerte Übereinstimmung der Modellvorhersagen mit früheren experimentellen HS-AFM-Bildgebungen von Proteinen. Die Ergebnisse können beispielsweise erklären, warum HS-AFM-Beobachtungen der Cas9-Endonuklease, einem Protein, das in gentechnischen Anwendungen eine Schlüsselrolle spielt, funktionelle Relativbewegungen von Ziel-DNA und Cas9 zuverlässig visualisieren und DNA-Spaltungsereignisse auf der Ebene einzelner Moleküle erfassen können .

Darüber hinaus kann das Modell, wie für die ATP-betriebene Chaperonmaschine ClpB gezeigt, erklären, wie sich Pufferbedingungen auf die Stabilität des Proben-Substrat-Komplexes auswirken, und Beobachtungen früherer HS-AFM-Experimente validieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die neue Methode es ermöglicht, die enorme Menge an verfügbaren Strukturdaten für Biomoleküle zu nutzen, um bereits vor einem tatsächlichen Experiment Vorhersagen über die Probenplatzierung auf AFM-Substraten zu treffen, und sie kann auch für die postexperimentelle Analyse von AFM-Bilddaten angewendet werden .

Die entwickelte Methode ist im frei verfügbaren BioAFMviewer-Softwarepaket implementiert und bietet eine praktische Plattform für Anwendungen durch die breite BioAFM-Community.