Forscher öffnen Tür zur fleckenfreien Markierung von Zellbestandteilen

Wissenschaftler der EPFL und des Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), der Universität Federico II und CEINGE-Biotecnologie avanzate in Neapel, Italien, haben eine neue Methode entwickelt, um einzelne Zellen schnell und zuverlässig ohne Fluoreszenzmarkierung zu screenen. Ihre Arbeit, veröffentlicht in der Zeitschrift Naturphotonikeröffnet neue Wege in der frühen Tumordiagnose und Arzneimittelentwicklung.

Unter dem Mikroskop können gesunde und kranke Zellen sehr schwer zu unterscheiden sein. Wissenschaftler verwenden Farbstoffe oder fluoreszierende Tags, die auf bestimmte Proteine ​​abzielen, um Zelltypen zu identifizieren, ihren Zustand zu charakterisieren und die Auswirkungen von Medikamenten und anderen Therapien zu untersuchen. Während seine Auswirkungen auf die Medizin transformierend waren, hat der Ansatz seine Grenzen. Zum einen ist das Markieren von Zellen teuer, zeitaufwändig und stark abhängig von den Fähigkeiten des Forschers. Darüber hinaus kann der Färbeprozess für die zu untersuchenden Zellen schädlich sein.

Aus diesem Grund haben Forscher alternative Methoden entwickelt, um einzelne Zellen schnell und zuverlässig zu screenen. In einem kürzlich in der Zeitschrift veröffentlichten Artikel Naturphotonik, Forscher der School of Engineering der EPFL und Kollegen des Instituts für Angewandte Wissenschaften und Intelligente Systeme, CNR, in Pozzuoli, Italien, stellen einen fleckenfreien Ansatz vor, der in der Lage ist, bestimmte Regionen innerhalb lebender Zellen genau zu unterscheiden. Durch die einzigartige Kombination von holografischer Bildgebung und Mikrofluidik mit neuronaler netzwerkbasierter Signalverarbeitung ebnet die Arbeit den Weg für Flüssigbiopsien zum Nachweis zirkulierender Tumorzellen und Hochdurchsatz-Assays für Arzneimitteltests.

Von der Phasenverzögerung bis zum Brechungsindex

Die Studie baut auf der Lerntomographie auf, einer Methode, die zuvor von Demetri Psaltis und seinem Team am Optiklabor der EPFL entwickelt wurde. Anstatt ein Mikroskop zu verwenden, um ein visuelles Bild der zu untersuchenden Probe zu erstellen, stützt sich die Lerntomographie auf die quantitative Phasenbildgebung, einen holographischen Bildgebungsansatz, der die Phasenverzögerung aufdeckt, die entsteht, wenn der Lichtstrahl des Mikroskops die Materie durchdringt, aus der die Zelle besteht.

Durch die Wiederholung dieses Vorgangs in mehreren verschiedenen Winkeln und das Durchlaufen der Phasendaten durch ein neuronales Netzwerk konnten die Forscher 3D-Karten des Brechungsindex jedes einzelnen Voxels erstellen – jedes dreidimensionale Volumen, das durch die Methode aufgelöst wurde. „Der Brechungsindex wird von der Dichte der Moleküle und des Materials beeinflusst“, erklärt Psaltis. Eine Erhöhung der Anzahl von Iterationen verbesserte die Genauigkeit der Schätzung der Brechungsindexverteilung weiter.

Zellbestandteile klassifizieren

In ihrer Veröffentlichung stellen Psaltis und sein Team vor, wie sie eine seit langem bestehende Einschränkung quantitativer Phasenbildgebungsansätze überwunden haben: die Unfähigkeit, intrazelluläre Komponenten zu identifizieren. „Durch die Verwendung eines Self-Clustering-Ansatzes, bei dem Voxel mit einem ähnlichen Brechungsindex in Verbindung mit Werkzeugen für maschinelles Lernen gruppiert werden, konnten wir die Cluster zu Formen zusammensetzen, die wir klassifizieren konnten. Verschiedene Arten von Kernen haben beispielsweise unterschiedliche Brechungsindizes“, sagt Psaltis . Das Schließen dieser Lücke ebnet den Weg für die quantitative Phasenbildgebung, um Einblicke zu liefern, die zuvor nur mit der Fluoreszenzmikroskopie erhältlich waren.

Eine zweite Herausforderung war die Entwicklung einer Methode zum Screenen von Zellen, die keine Immobilisierung erforderten. Die Lösung für diese Herausforderung kam von Co-Autor Pietro Ferraro und seinem Labor bei CNR, die über umfangreiche Erfahrung in der Arbeit mit In-Flow-Tomographie unter Verwendung von Lab-on-Chip-Geräten verfügten. „Die Idee war, die Zellen in einen Flüssigkeitskanal mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikrometern zu legen und den Strömungsgeschwindigkeitsgradienten im Kanal die Zellen rotieren zu lassen“, sagt Psaltis. „Indem wir die Zellen mit einem stationären Strahl und Detektor beobachten, während sie entlang des Kanals taumeln, können wir die Phasenverzögerung erkennen, die Ausrichtung der Zelle abschätzen und unseren Lerntomographie-Ansatz anwenden, um die 3D-Brechungsindexkarten zu erstellen.“

„Die erreichbare Querauflösung liegt bei einem halben Mikrometer bis zu einem Mikrometer“, sagt Psaltis. „Wir können keine einzelnen Proteine ​​erkennen, aber wir können Proteinaggregate sehen, die in der Regel mehrere zehn Mikrometer groß sind. Dadurch können wir auch die Größe des Zellkerns und die Umrisse der Zelle beurteilen, die weniger glatt werden, wenn Zellen krebsartig werden .“ Die Forscher validierten ihre Methodik, indem sie ihre Ergebnisse mit Beobachtungen verglichen, die mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, dem heutigen Goldstandard in der 3D-Zellbildgebung, gemacht wurden.

Hochdurchsatz-Screening einzelner Zellen

Eine wesentliche Anwendung des fleckenfreien Zellscreenings sind Flüssigbiopsien, die den Nachweis zirkulierender Krebszellen ermöglichen, die sowohl zur Identifizierung von Krebsarten in der Chirurgie als auch als Früherkennungsinstrument für Krebsmetastasen verwendet werden.

Ein weiterer Bereich ist die Arzneimittelentwicklung. Viele Krankheiten wie Parkinson werden mit vernetzten Proteinen in Verbindung gebracht. Der von Psaltis und seinen Mitarbeitern entwickelte Ansatz bietet eine hocheffiziente, nicht-invasive Möglichkeit, die Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten, die diese vernetzten Proteine ​​in Echtzeit abbauen sollen, indem behandelte Zellen wiederholt durch die Bildgebungseinrichtung geführt werden. Ebenso könnte der Ansatz genutzt werden, um Forschern neue Einblicke in die Echtzeitwirkung von Krankheitserregern auf gesunde Zellen zu geben.

Laut Psaltis wird die zukünftige Arbeit darin bestehen, maschinelle Lernwerkzeuge anzuwenden, um biologisch relevante Informationen und konkrete Diagnosen aus der geschätzten Brechungsindexverteilung zu extrahieren.