Forscher machen Genom-Prime-Editoren kleiner und effizienter für therapeutische Anwendungen

Prime-Editing-Technologien ermöglichen es Wissenschaftlern, das Genom auf vielfältige Weise präzise zu bearbeiten und könnten eines Tages zur Behandlung genetischer Krankheiten eingesetzt werden. Nun haben Forscher am Broad Institute of MIT und Harvard modernste kontinuierliche Laborevolution und technische Methoden genutzt, um verbesserte Versionen des Gen-Editing-Tools zu entwickeln.

Ihre neuen Editoren sind effizienter und spezialisierter als frühere Versionen und können DNA in kultivierten Zellen und bei Tieren modifizieren, die bisher schwer zu bearbeiten waren, einschließlich Zellen des Immunsystems und im Gehirn. Die Bearbeitungsmoleküle sind außerdem kleiner, was es möglicherweise einfacher macht, sie als neue Krankheitsbehandlungen in Zellen in wichtigen Teilen des Körpers einzuschleusen.

Prime Editing kann gezielte Einfügungen, Löschungen und andere Veränderungen an der DNA vornehmen und wurde erstmals 2019 vom Labor von David Liu, Mitglied des Kerninstituts, Richard Merkin Professor und Direktor des Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare am Broad Institute, beschrieben .

Die Technik kombiniert mehrere molekulare Maschinen: ein deaktiviertes Cas9-Protein, das DNA stehlen kann; eine konstruierte Prime Editing Guide RNA (pegRNA), die sowohl den Ort der Bearbeitung angibt als auch neue genetische Anweisungen zur Installation an diesem Ort enthält; und eine manipulierte Version eines Enzyms namens Reverse Transkriptase, das diese RNA als Vorlage verwendet, um spezifische Veränderungen an der DNA vorzunehmen.

In der Vergangenheit haben Broad-Forscher die pegRNA und die Art und Weise, wie die Zelle auf Prime Editing reagiert, optimiert, um die Editierungseffizienz zu steigern. In der neuen Arbeit konzentrierten sie sich auf die Verbesserung des Kernstücks des Prime-Editing-Systems – der Reverse Transkriptase. Ihre Bemühungen haben eine Reihe neuer Hauptredakteure hervorgebracht, die sich jeweils im Labor weiterentwickelt haben, um sich auf unterschiedliche Bearbeitungsaufgaben zu spezialisieren. In einem am 31. August veröffentlichten Artikel Zellestellt das Team die wichtigsten Editiersysteme vor, die als PE6a bis PE6g bezeichnet werden und jeweils eine neue Reverse-Transkriptase- oder Cas9-Variante enthalten.

Die neuen Prime-Editoren sind zwei- bis 20-mal effizienter als die Vorgänger, was sie möglicherweise als Therapeutika nützlicher macht. Die Forscher nutzen die PE6-Editoren bereits in fast allen ihrer Hauptbearbeitungsprojekte, um eine Vielzahl von Zelltypen zu bearbeiten, darunter bei Tieren und in therapeutisch relevanten kultivierten Zellen.

„Wir freuen uns sehr, diese hochmodernen erstklassigen Bearbeitungstools mit der Community zu teilen“, sagte Liu, der auch Professor an der Harvard University und Forscher am Howard Hughes Medical Institute ist. „Wir hoffen, dass diese neuen Top-Editoren ein integraler Bestandteil des Gen-Editing-Bereichs werden, der so viel Versprechen und Fortschritt in den Biowissenschaften und der Medizin gebracht hat.“

Jordan Doman und Smriti Pandey, Doktoranden im Liu-Labor, sind Co-Erstautoren der Studie. Sie weisen darauf hin, dass diese neue Studie im Sommer 2019 begann, bevor das Liu-Labor überhaupt über das erste erstklassige Bearbeitungssystem berichtete.

„In den Anfängen dieses Projekts ging es darum herauszufinden, wie diese komplizierte molekulare Maschine funktioniert und welche Präferenzen sie hat. In jüngerer Zeit haben wir dann daran gearbeitet, dieses verbesserte Verständnis in verbesserte Werkzeuge und potenzielle Therapeutika umzuwandeln“, sagte Doman.

Optimierung jeder Komponente

Die Erstbearbeitung verspricht, die meisten krankheitsverursachenden genetischen Mutationen zu korrigieren, ihre Effizienz kann jedoch je nach Ort und Art der Bearbeitung sowie der Art der bearbeiteten Zellen stark variieren. In einigen Fällen erhalten nur wenige Prozent der Zellen, die einem Primäreditor ausgesetzt sind, die gewünschte genetische Bearbeitung.

Um diese Effizienz für therapeutische Anwendungen zu verbessern, hat sich Lius Team auf die Untersuchung und Verbesserung jedes Teils des komplexen Primärbearbeitungssystems konzentriert.

„Wir hatten zuvor alle anderen Komponenten der Hauptbearbeitungsmaschinerie optimiert“, sagte Liu. „Was bisher noch nicht gelungen ist, ist die Verbesserung der Reverse Transkriptase auf eine Art und Weise, die für Prime Editing maßgeschneidert ist.“

Reverse-Transkriptase-Proteine, die RNA-Vorlagen in DNA-Stränge kopieren, kommen natürlicherweise in allen pflanzlichen und tierischen Zellen sowie in vielen Viren vor. Aber natürlich vorkommende Reverse Transkriptasen führen im Allgemeinen zu einer schlechten Prime-Editing-Effizienz, und Forscher hatten bisher nicht über Reverse Transkriptasen berichtet, die die Editing-Effizienz von Prime-Editoren kontinuierlich über die der im ursprünglichen Prime-Editing-System verwendeten manipulierten Reverse Transkriptase hinaus steigern.

Um die Reverse-Transkriptase-Domäne von Prime-Editoren gezielter zu optimieren, wandte sich Lius Gruppe an PACE (Phage-Assisted Continuous Evolution), einen 2011 von Liu entwickelten gerichteten Evolutionsansatz. Die Methode beinhaltet die Züchtung einer Vielfalt sich schnell entwickelnder Bakteriophagen – der Viren, die Bakterien infizieren – in Labor-„Lagunen“, die einer kontinuierlichen Verdünnung unterliegen. Nur diejenigen, die Genvarianten mit bestimmten wünschenswerten Merkmalen exprimieren, können überleben, indem sie sich schneller replizieren als sie verdünnt werden.

In der neuen Arbeit entwickelten die Wissenschaftler ein PACE-System, das eine darwinistische Selektion für Bakteriophagen durchführte, die eine Erstbearbeitung durchführen konnten, um ein defektes Bakteriophagen-Gen zu korrigieren. Im Laufe von Hunderten von Stunden durchliefen die Bakteriophagen, die die Haupteditoren kodierten, Tausende von Generationen der Evolution und erzeugten schnell neue Reverse Transkriptasen, die effizientere Bearbeitungen durchführen.

Lius Team forderte das PACE-System mit verschiedenen Arten grundlegender Bearbeitungsaufgaben heraus, etwa dem Einfügen kurzer oder langer DNA-Abschnitte, und testete dann die überlebenden Editoren. Überraschenderweise stellten die Forscher fest, dass weiterentwickelte Prime-Editoren, die die Bearbeitungseffizienz bei einer Aufgabe verbesserten, etwa beim Hinzufügen oder Ersetzen nur einiger DNA-Buchstaben, in anderen Kontexten, etwa beim Hinzufügen langer DNA-Abschnitte, schlecht abschnitten.

„Es stellte sich heraus, dass PACE diese erstklassigen Redakteure weiterentwickelt hat, um sich genau auf die Art von Bearbeitungen zu spezialisieren, die wir während PACE von ihnen verlangt haben“, sagte Liu. „Aber ein Editor, der bei einer Bearbeitung am besten funktionierte, funktionierte bei einer anderen nicht am besten. Diese Entdeckung widerlegt die Annahme, dass ein Typ von Haupteditor jede Art von Hauptbearbeitung optimal ausführen kann.“

Auf dem Weg zur Therapie

Als das Team die von PACE entwickelten Editoren in verschiedenen Szenarien testete, enthüllte es eine Reihe von Regeln, die vorschrieben, wann jedes der sieben Hauptbearbeitungssysteme verwendet werden sollte, und führte dann weitere Experimente durch, um deren Nützlichkeit zu demonstrieren.

Sie zeigten beispielsweise, dass einige PE6-Varianten längere DNA-Abschnitte mit einer Länge von 38 bis 108 Basenpaaren an fünf verschiedenen Stellen in das Genom einer menschlichen Zelllinie einfügen können, wobei die Bearbeitungseffizienz im Vergleich zu aktuellen Haupteditoren erhöht ist. Diese PE6-Varianten zeigten besonders gute Ergebnisse in Umgebungen, deren Bearbeitung für Forscher eine Herausforderung darstellte, beispielsweise im Gehirn lebender Mäuse.

„Nach Jahren der Optimierung waren wir begeistert, dass PE6-Varianten den Umfang des Prime-Editing erweitern“, sagte Co-Erstautor Pandey. „PE6-Varianten können insbesondere die Bearbeitung an wichtigen therapeutisch relevanten Stellen verbessern, die mit früheren Systemen schwieriger zu erreichen waren.“

In einem Experiment gelang es den Forschern, eine lange DNA-Sequenz in 40 % der Zellen in der Hirnrinde einer Maus einzufügen – eine 24-fache Verbesserung gegenüber dem bisherigen hochmodernen Prime-Editing-System.

„Der Unterschied zwischen einer Bearbeitungseffizienz von weniger als 2 % und einer Bearbeitungseffizienz von 40 % kann den Unterschied zwischen etwas, das ein interessantes Forschungsinstrument ist, und etwas, das eine potenzielle therapeutische Anwendung unterstützen kann, ausmachen“, sagte Liu.

Die neuen Prime-Editoren sind außerdem kompakter als frühere Versionen, sodass die gesamte Prime-Editing-Plattform in einige Bereitstellungssysteme passt, in die frühere Prime-Editoren nur schwer passen konnten. Die optimierten Haupteditoren lassen sich möglicherweise einfacher in Tiermodellen und schließlich auch bei menschlichen Patienten einsetzen.

„Der eigentliche Lackmustest dafür, ob eine Technologie nützlich ist, besteht darin, ob die Menschen sie letztendlich übernehmen“, sagte Liu. „Wir sind gespannt, wie PE6 auf den Hauptbearbeitungsbereich angewendet wird.“