Im Rahmen einer Entwicklung, die die Entdeckung neuer Diagnostika und Behandlungen beschleunigen könnte, haben Forscher am Children’s Hospital of Philadelphia (CHOP) eine vielseitige und kostengünstige Technologie zur gezielten Sequenzierung von RNA-Molekülen voller Länge entwickelt. Die TEQUILA-seq genannte Technologie ist im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Lösungen zur gezielten RNA-Sequenzierung äußerst kostengünstig und kann für verschiedene Forschungs- und klinische Zwecke angepasst werden. Die Einzelheiten sind in einem Artikel in beschrieben Naturkommunikation.
Auf dem Weg vom Gen zum Protein kann ein RNA-Molekül auf unterschiedliche Weise geschnitten und verbunden werden, bevor es in ein Protein übersetzt wird. Dieser Prozess wird als alternatives Spleißen bezeichnet und ermöglicht es einem einzelnen Gen, mehrere verschiedene Proteine zu kodieren. Obwohl alternatives Spleißen in vielen biologischen Prozessen auftritt, kann es bei Krankheiten wie Krebs fehlreguliert sein, was zu pathogenen RNA-Molekülen führt. Um zu verstehen, wie alternatives Spleißen zu Krankheiten führen kann, müssen Forscher alle RNA-Moleküle (bekannt als „Transkript-Isoformen“), die von einem einzelnen Gen ausgehen, genau erfassen.
Eine Möglichkeit hierfür ist der Einsatz von „Long-Read“-RNA-Sequenzierungsplattformen, die RNA-Moleküle mit einer Länge von über 10.000 Basen Ende-zu-Ende sequenzieren und dabei die Gesamtheit der Transkript-Isoformen erfassen. Diese Long-Read-Plattformen weisen jedoch eine bescheidene Sequenzierungsausbeute auf, was ihre weitverbreitete Einführung, insbesondere im klinischen Umfeld, behindert hat, da die Generierung von Long-Read-RNA-Sequenzierungsdaten mit klinisch informativer Tiefe unerschwinglich teuer sein könnte. Die gezielte Sequenzierung, bei der bestimmte interessierende Nukleinsäuresequenzen vor der Sequenzierung angereichert werden, ist eine nützliche Strategie, die die Abdeckung vordefinierter Ziele erheblich verbessern kann. Die Kosten und die Komplexität der Zielerfassung waren jedoch Hindernisse für eine breitere Verwendung.
„Gezielte Long-Read-RNA-Sequenzierung ist eine wirkungsvolle Strategie zur Aufklärung des RNA-Repertoires für jeden vordefinierten Satz von Genen. Allerdings sind bestehende Technologien zur gezielten Sequenzierung von RNA-Molekülen voller Länge entweder teuer oder schwierig einzurichten, was sie unerreichbar macht.“ für viele Labore“, sagte Co-Seniorautor Lan Lin, Ph.D., Assistenzprofessor für Pathologie und Labormedizin und Mitglied des Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics am CHOP. „TEQUILA-seq löst dieses Problem, indem es sowohl kostengünstig als auch einfach zu verwenden ist. Die Technologie kann von Benutzern für verschiedene Zwecke angepasst werden, und Forscher können auswählen, welche Gene sie sequenzieren möchten, und die Reagenzien für die Zielerfassung in ihren eigenen Labors herstellen. Dies.“ hat das Potenzial, die Entdeckung neuer diagnostischer und therapeutischer Lösungen für ein breites Spektrum von Krankheiten zu beschleunigen.“
Eine Methode, die eine gezielte Sequenzierung ermöglicht, ist die sogenannte „Hybridization Capture-based Enrichment“, bei der kurze Nukleinsäurestücke, sogenannte Oligonukleotide, als Einfangsonden verwendet werden. Diese Oligonukleotide (oft einfach als „Oligos“ bezeichnet) sind mit Biotinmolekülen markiert und so konzipiert, dass sie auf der Grundlage der Komplementarität der Nukleinsäuresequenzen an ihre Ziele hybridisieren, was eine einfache Erfassung und Isolierung ihrer Zielsequenzen aus einer biologischen Probe ermöglicht. Obwohl die Hybridisierungs-Capture-basierte Anreicherung eine effiziente Methode zur gezielten Sequenzierung ist, sind kommerziell synthetisierte biotinylierte Capture-Sonden teuer und können nur für eine begrenzte Anzahl von Reaktionen verwendet werden, was die Kosten pro Probe für jede Capture-Reaktion hoch macht.
Um dieser Einschränkung zu begegnen, entwickelten die CHOP-Forscher TEQUILA-seq (Transcript Enrichment and Quantification Utilizing Isothermally Linear-Amplified Probes in Verbindung mit Long-Read-Sequenzierung). Eine Schlüsselinnovation in TEQUILA-seq ist eine durch Nicking-Endonuklease ausgelöste isotherme Strangverdrängungs-Amplifikationsreaktion, die große Mengen biotinylierter Einfangsonden aus einem günstigen Pool nicht biotinylierter Oligos als Matrizen synthetisieren kann. Mit einer Eingabe von nur 2 ng Template-Oligos können die Forscher 25 ug TEQUILA-Sonden erzeugen, die für mindestens 250 Einfangreaktionen verwendet werden können. Diese innovative Strategie zur Synthese von Einfangsonden macht TEQUILA-seq äußerst kosteneffektiv und skalierbar für große Zielgruppen und viele biologische Proben.
Um die Leistung zu vergleichen, führten die Forscher TEQUILA-seq für mehrere Gen-Panels an synthetischen RNAs oder menschlichen RNAs durch. TEQUILA-Sonden leisteten bei der Zielerfassung und -anreicherung eine ebenso gute Leistung wie kommerzielle Einfangsonden, waren dabei jedoch für jede Einfangreaktion hundertmal günstiger. Darüber hinaus zeigten die Forscher, dass TEQUILA-seq die Erkennung erheblich verbessern und gleichzeitig die Quantifizierung der Ziel-RNA-Moleküle beibehalten kann.
„Durch den Einsatz kostengünstiger Reagenzien und eines einfachen experimentellen Arbeitsablaufs können wir mit TEQUILA-seq die RNA-Moleküle voller Länge für jeden Gensatz in vielen biologischen Proben gründlich sequenzieren“, sagte Co-Seniorautor Yi Xing, Ph.D., Direktor des Zentrums für Computational and Genomic Medicine am CHOP. „Das ist sehr spannend und ermöglicht ein breites Spektrum medizinischer Anwendungen, von der RNA-gesteuerten Gendiagnose bis zur Therapieentwicklung.“
Um den biomedizinischen Nutzen zu veranschaulichen, verwendeten die Forscher TEQUILA-seq, um RNA-Moleküle voller Länge von 468 umsetzbaren Krebsgenen in 40 Brustkrebszelllinien zu profilieren. Sie entdeckten bisher unbekannte Transkript-Isoformen in umfassend untersuchten Krebsgenen, die Aufschluss darüber geben könnten, wie Gene, die den Körper vor Krebs schützen, in einzelnen Tumoren inaktiviert werden.
„Unsere Arbeit zeigt, dass TEQUILA-seq umfassend für die gezielte Sequenzierung von RNA-Molekülen voller Länge eingesetzt werden kann“, sagte Dr. Lin. „Darüber hinaus handelt es sich bei TEQUILA-Sonden um Allzweck-Einfangsonden. Sie sind sowohl für die gezielte RNA- als auch für die DNA-Sequenzierung kompatibel, sowohl auf Long-Read- als auch auf Short-Read-Sequenzierungsplattformen. Die Möglichkeit, problemlos große Mengen biotinylierter Einfangsonden für jedes Zielpanel zu erzeugen.“ zu geringen Kosten und mit Leichtigkeit kann groß angelegte und bevölkerungsbezogene Studien für viele grundlegende, translationale und klinische Anwendungen ermöglichen.“
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Feng Wang et al., TEQUILA-seq: eine vielseitige und kostengünstige Methode zur gezielten Long-Read-RNA-Sequenzierung, Naturkommunikation (2023). DOI: 10.1038/s41467-023-40083-6