Forscher der Universität Toronto haben ein bakterielles Immunabwehrsystem namens CRISPR nutzbar gemacht, um den Prozess des RNA-Spleißens effizient und präzise zu steuern. Die Technologie öffnet die Tür zu neuen Anwendungen, darunter die systematische Abfrage der Funktionen von Teilen von Genen und die Korrektur von Spleißdefiziten, die zahlreichen Krankheiten und Störungen zugrunde liegen.
Die Forschung ist veröffentlicht im Journal Molekulare Zelle.
„Fast alle menschlichen Gene produzieren RNA-Transkripte, die den Prozess des Spleißens durchlaufen, wobei codierende Segmente, sogenannte Exons, zusammengefügt und nicht-codierende Segmente, sogenannte Introns, entfernt und typischerweise abgebaut werden“, sagte Jack Daiyang Li, Erstautor der Studie und Doktorand der Molekulargenetik, der in den Laboren von Benjamin Blencowe und Mikko Taipale am Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research der Universität Toronto arbeitet.
Durch alternatives Spleißen von Exons wird die Regulierung und Funktion der etwa 20.000 menschlichen Gene, die Proteine kodieren, erheblich diversifiziert, was die Entwicklung und funktionelle Spezialisierung verschiedener Zelltypen ermöglicht.
Es ist jedoch unklar, was die meisten Exons oder Introns tun, und die Fehlregulierung normaler alternativer Spleißmuster ist eine häufige Ursache oder ein beitragender Faktor für verschiedene Krankheiten wie Krebs und Gehirnerkrankungen. Bisher fehlten jedoch Methoden, die eine präzise und effiziente Manipulation des Spleißens ermöglichen.
In der neuen Forschungsstudie wurde eine katalytisch deaktivierte Version eines auf RNA ausgerichteten CRISPR-Proteins, genannt dCasRx, mit mehr als 300 Spleißfaktoren verbunden, um ein Fusionsprotein, dCasRx-RBM25, zu entdecken. Dieses Protein ist in der Lage, alternative Exons effizient und gezielt zu aktivieren oder zu unterdrücken.
„Unser neues Effektorprotein aktivierte das alternative Spleißen von rund 90 Prozent der getesteten Zielexons“, sagte Li. „Wichtig ist, dass es in der Lage ist, verschiedene Exons gleichzeitig zu aktivieren und zu unterdrücken, um ihre kombinierten Funktionen zu untersuchen.“
Diese mehrstufige Manipulation wird die experimentelle Prüfung funktioneller Interaktionen zwischen alternativ gespleißten Varianten von Genen erleichtern, um ihre kombinierte Rolle in kritischen Entwicklungs- und Krankheitsprozessen zu bestimmen.
„Unser neues Werkzeug ermöglicht eine breite Palette von Anwendungen, von der Untersuchung der Genfunktion und -regulierung bis hin zur potenziellen Korrektur von Spleißdefekten bei menschlichen Störungen und Krankheiten“, sagte Blencowe, Hauptforscher der Studie, Inhaber des Canada Research Chair in RNA Biology and Genomics, des Banbury Chair in Medical Research und Professor für Molekulargenetik am Donnelly Centre und der Temerty Faculty of Medicine.
„Wir haben einen vielseitigen, konstruierten Spleißfaktor entwickelt, der andere verfügbare Werkzeuge bei der gezielten Kontrolle alternativer Exons übertrifft“, sagte Taipale, ebenfalls Studienleiter, Inhaber des Canada Research Chair in Functional Proteomics and Proteostasis, des Anne and Max Tanenbaum Chair in Molecular Medicine und außerordentlicher Professor für Molekulargenetik am Donnelly Centre und Temerty Medicine.
„Es ist auch wichtig zu beachten, dass Zielexons durch diesen Spleißfaktor mit bemerkenswert hoher Spezifität gestört werden, was Bedenken hinsichtlich möglicher Off-Target-Effekte lindert.“
Die Forscher verfügen nun über ein Werkzeug zum systematischen Screening alternativer Exons, um deren Rolle beim Zellüberleben, der Zelltypspezifikation und der Genexpression zu bestimmen.
In der Klinik könnte das Spleißwerkzeug möglicherweise zur Behandlung zahlreicher menschlicher Störungen und Krankheiten eingesetzt werden, bei denen das Spleißen häufig gestört ist, etwa bei Autismus und Krebs.
Mehr Informationen:
Jack Daiyang Li et al, Effiziente, spezifische und kombinatorische Kontrolle des endogenen Exon-Spleißens mit dCasRx-RBM25, Molekulare Zelle (2024). DOI: 10.1016/j.molcel.2024.05.028