Ein Forscherteam hat ein Softwaretool namens DANGER (Deleterious and ANticipatable Guides Evaluated by RNA-sequencing)-Analyse entwickelt, das eine Möglichkeit für eine sicherere Gestaltung der Genombearbeitung in allen Organismen mit einem Transkriptom bietet.
Seit etwa einem Jahrzehnt nutzen Forscher die CRISPR-Technologie zur Genombearbeitung. Allerdings gibt es bei der Verwendung von CRISPR einige Herausforderungen. Die DANGER-Analyse überwindet diese Herausforderungen und ermöglicht es Forschern, sicherere On- und Off-Target-Bewertungen ohne Referenzgenom durchzuführen. Es birgt Potenzial für Anwendungen in der Medizin, Landwirtschaft und biologischen Forschung.
Ihre Arbeit war veröffentlicht im Tagebuch Fortschritte in der Bioinformatik am 23. August 2023.
Unter Genombearbeitung oder Genbearbeitung versteht man Technologien, die es Forschern ermöglichen, die genomische DNA eines Organismus zu verändern. Mit diesen Technologien können Forscher genetisches Material im Genom hinzufügen, entfernen oder verändern.
CRISPR-Cas9 ist eine bekannte Gen-Editing-Technologie. Es hat den Ruf, genauer, schneller und kostengünstiger zu sein als andere ähnliche Technologien. Allerdings birgt die Genbearbeitung mithilfe der CRISPR-Technologie einige Herausforderungen. Die erste Herausforderung besteht darin, dass die phänotypischen oder beobachtbaren Effekte, die durch unerwartete CRISPR-Dynamik verursacht werden, nicht quantitativ überwacht werden.
Eine zweite Herausforderung besteht darin, dass die CRISPR-Technologie im Allgemeinen auf grundlegenden Genomdaten, einschließlich des Referenzgenoms, basiert. Das Referenzgenom ist wie eine Vorlage, die Forschern allgemeine Informationen über das Genom liefert. Es kann zu unerwarteten Sequenzbearbeitungen mit Nichtübereinstimmungen kommen. Diese Off-Target-Sites kommen immer unerwartet. Daher benötigen Forscher eine Möglichkeit, tatsächliche Genomsequenzen zu beobachten und mögliche Effekte außerhalb des Ziels zu begrenzen.
„Das Design der Genombearbeitung erfordert eine gut charakterisierte Genomsequenz. Allerdings sind die Genominformationen von Patienten, Krebserkrankungen und nicht charakterisierten Organismen oft unvollständig“, sagte Kazuki Nakamae, Assistenzprofessor des PtBio Collaborative Research Laboratory am Genome Editing Innovation Zentrum, Universität Hiroshima.
Das Forschungsteam machte sich daran, eine Methode zu entwickeln, um die Probleme der phänotypischen Effekte und der Abhängigkeit von einem Referenzgenom zu lösen. Die DANGER-Analysesoftware des Teams meistert diese Herausforderungen. Das Team nutzte gentechnisch veränderte Proben menschlicher Zellen und Zebrafischgehirne, um seine risikoaverse On- und Off-Target-Bewertung in RNA-Sequenzierungsdaten durchzuführen.
Das Team zeigte, dass die DANGER-Analysepipeline mehrere Ziele erreicht. Mithilfe von RNA-Sequenzierungsdaten wurden potenzielle On- und Off-Target-Stellen der DNA in der mRNA-transkribierten Region des Genoms entdeckt. Es bewertete die phänotypischen Auswirkungen schädlicher Off-Target-Sites auf der Grundlage der durch Genexpressionsänderungen bereitgestellten Beweise. Es quantifizierte das phänotypische Risiko auf der Ebene der Genontologie-Begriffe, ohne ein Referenzgenom.
Dieser Erfolg zeigte, dass die GEFAHRENanalyse an verschiedenen Organismen, persönlichen menschlichen Genomen und atypischen Genomen, die durch Krankheiten und Viren entstanden sind, durchgeführt werden kann.
Die DANGER-Analysepipeline identifiziert die genomischen On- und Off-Target-Sites auf der Grundlage der De-novo-Transkriptomassemblierung unter Verwendung von RNA-Sequenzierungsdaten.
Ein Transkriptom umfasst eine Sammlung aller aktiven Gen-Readouts in einer Zelle. Bei der De-novo-Transkriptomassemblierung wird das Transkriptom ohne die Hilfe eines Referenzgenoms zusammengesetzt. Als nächstes identifiziert die GEFAHREN-Analyse die schädlichen Off-Targets. Hierbei handelt es sich um Off-Targets auf den mRNA-transkribierten Regionen, die die Herunterregulierung der Expression in editierten Proben im Vergleich zu Wildtyp-Proben darstellen. Schließlich quantifiziert die Software das phänotypische Risiko anhand der Genontologie der schädlichen Off-Targets.
„Unsere DANGER-Analyse ist eine neuartige Software, die die Quantifizierung phänotypischer Effekte ermöglicht, die durch geschätzte Abweichungen vom Ziel verursacht werden. Darüber hinaus nutzt unser Tool die De-novo-Transkriptomassemblierung, deren Sequenzen aus RNA-Sequenzierungsdaten behandelter Proben ohne Referenzgenom erstellt werden können“, sagte Hidemasa Bono, Professor am Genome Editing Innovation Center der Universität Hiroshima.
Mit Blick auf die Zukunft hofft das Team, seine Forschung mithilfe der DANGER-Analyse zu erweitern. „Wir werden die Software auf verschiedene Genombearbeitungsproben von Patienten und Nutzpflanzen anwenden, um den phänotypischen Effekt zu klären und sicherere Strategien für die Genombearbeitung zu entwickeln“, sagte Nakamae.
Die Gefahrenanalyse ist Open Source und frei anpassbar. Der Algorithmus dieser Pipeline könnte also für die Analyse verschiedener Genom-Editierungssysteme außerhalb des CRISPR-Cas9-Systems umfunktioniert werden. Es ist auch möglich, die Spezifität der GEFAHREN-Analyse für CRISPR-Cas9 zu verbessern, indem CRISPR-Cas9-spezifische Off-Target-Scoring-Algorithmen integriert werden.
Das Team ist davon überzeugt, dass die DANGER-Analysepipeline den Umfang genomischer Studien und industrieller Anwendungen mithilfe der Genombearbeitung erweitern wird.
Mehr Informationen:
Kazuki Nakamae et al., DANGER-Analyse: Risikoaverse On/Off-Target-Bewertung für die CRISPR-Bearbeitung ohne Referenzgenom, Fortschritte in der Bioinformatik (2023). DOI: 10.1093/bioadv/vbad114