Die meiotische Rekombination erzeugt genetische Vielfalt und fördert die ordnungsgemäße Chromosomentrennung der Elternchromosomen. Dieser Prozess erfordert eine Reihe von Rekombinasen, die auf einzelsträngigen (ss) DNAs, dem sogenannten Nukleoproteinfilament, polymerisiert sind, um eine Homologiesuche und einen Strangaustausch zwischen homologen DNAs durchzuführen.
Bei der Meiose von Saccharomyces cerevisiae werden von Spo11 programmierte DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) gebildet, um 3′-ssDNA-Schwänze zu erzeugen. Einmal gebildet, werden ssDNA-Überhänge schnell durch das reichlich vorhandene hochaffine ssDNA-bindende Protein, Replikationsprotein A (RPA), gebunden, um diese ssDNAs vor nukleolytischem Abbau oder der Bildung von DNA-Strukturen höherer Ordnung zu schützen.
RPA-beschichtete ssDNA-Substrate unterscheiden sich von reinen ssDNA-Substraten aufgrund der hohen Affinität von RPA zu ssDNA; Daher ist der Rekombinationsmediator-Mei5-Sae3-Proteinkomplex für die Bindung von Rekombinasen an RPA-beschichtete ssDNA erforderlich. Die mechanistische Rolle von Mei5-Sae3 bei der Vermittlung der Dmc1-Aktivität bleibt jedoch unklar.
Um zu untersuchen, wie Mei5-Sae3 Dmc1 dazu anregt, RPA zu verdrängen und Nukleoproteinfilamente zu bilden, nutzte das Forschungsteam von NTU Chemistry, NTU IBS und der Universität Osaka biochemische Proteinreinigungstechniken sowie Einzelmolekül-FRET und Kolokalisierungs-Einzelmolekülspektroskopie (CoSMoS). Techniken zur Erfassung der Echtzeitbindung von Dmc1 und der Dissoziation von RPA an individueller DNA mit außergewöhnlicher Zeitauflösung.
Ihre Ergebnisse sind veröffentlicht im Tagebuch Nukleinsäureforschung.
Im Gegensatz zu herkömmlichen biologischen Ansätzen, die sich hauptsächlich mit den endgültigen Gleichgewichtsprodukten der Ensemblereaktionen befassen, könnten Einzelmolekülmethoden die Beiträge einzelner biochemischer Schritte einzelner Moleküle aufklären und vorübergehende Zwischenzustände aufdecken, die Einblicke in den Reaktionsverlauf geben könnten.
Das Ergebnis zeigte, dass Mei5-Sae3 Dmc1-Keimbildungscluster mit 2–3 Molekülen auf nackter DNA stabilisierte, indem es die Dmc1-Dissoziationsraten bevorzugt reduzierte. Mei5-Sae3 stimulierte auch die Dmc1-Assemblierung auf RPA-beschichteter DNA.
Unter Verwendung von GFP-markiertem RPA wurde die Koexistenz eines Zwischenprodukts mit Dmc1 und RPA auf ssDNA vor der RPA-Dissoziation beobachtet. Darüber hinaus hing die Verdrängungseffizienz von RPA von der Dmc1-Konzentration ab und ihre Abhängigkeit korrelierte positiv mit der Stabilität von Dmc1-Clustern auf kurzer ssDNA.
Diese Ergebnisse legen ein molekulares Modell nahe, bei dem Mei5-Sae3 die Dmc1-Bindung an RPA-beschichteter ssDNA vermittelt, indem es Dmc1-Keimbildungscluster stabilisiert und dadurch die RPA-Dynamik auf der DNA beeinflusst, um die RPA-Dissoziation zu fördern.
Die Forschung trägt zum ersten detaillierten molekularen Modell für dieses einzigartige Mediatorprotein Mei5-Sae3 bei und erklärt, wie eine Mediator-Rekombinase-Wechselwirkung die Rekombinase-Assemblierung auf RPA-beschichteter ssDNA stimulieren kann.
Weitere Informationen:
Chin-Dian Wei et al., Mei5–Sae3 stabilisiert Dmc1-Keimbildungscluster für eine effiziente Dmc1-Assemblierung auf RPA-beschichteter einzelsträngiger DNA, Nukleinsäureforschung (2024). DOI: 10.1093/nar/gkae780
Zur Verfügung gestellt von der National Taiwan University