Ein Forscherteam unter der Leitung von Professor Koji Eto (Abteilung für klinische Anwendung) entdeckte kürzlich die Bedeutung eines auf microRNA basierenden Regulierungsmechanismus für die Verbesserung der Qualität und Quantität der Blutplättchen, die von Megakaryozyten aus iPS-Zellen erzeugt werden. Die Ergebnisse sind veröffentlicht im Tagebuch Naturkommunikation.
Megakaryozyten (MKs) sind traditionell für ihre primäre Funktion der Blutplättchenproduktion bekannt. Neue Erkenntnisse der letzten Jahre deuten jedoch darauf hin, dass sie möglicherweise auch immunmodulatorische Funktionen besitzen.
Das Forschungsteam erkannte, dass Heterogenität ein kritisches Problem ist, das die hochwertige Ex-vivo-Herstellung von aus iPS-Zellen gewonnenen Blutplättchen (iPSC-PLT) aus immortalisierten MK-Vorläuferzelllinien (imMKCLs) behindert, und stellte die Frage, ob sie spezifische imMKCL-Subpopulationen auf der Grundlage differenzieller microRNA identifizieren könnten (miRNA)-Aktivität.
Mithilfe der von Professor Hirohide Saito (Department of Life Science Frontiers) entwickelten miRNA-Schaltertechnologie durchsuchten die Forscher eine Bibliothek von mehr als 250 miRNA-Schaltern und identifizierten 24 aktive miRNAs in imMKCLs. Von diesen aktiven miRNAs konzentrierten sie sich auf let-7a-5p- und let-7g-5p-miRNAs, da sie unterschiedliche imMKCL-Subpopulationen mit entweder hoher oder niedriger Aktivität dieser miRNAs beobachteten.
Als nächstes trennten die Forscher imMKCLs in let-7-Subpopulationen mit hohem und niedrigem Let-7-Wert, um ihre Genexpressionsmuster während der Proliferation oder Reifung durch Massen-RNA-Sequenzierung (RNA-seq) zu untersuchen. Insbesondere fanden sie heraus, dass immunbezogene Gene sowohl in niedrig proliferierenden let-7-Subpopulationen als auch in reifen imMKCL-Subpopulationen angereichert waren, was für MK-Vorläuferzellen mit immunmodulatorischen Funktionen charakteristisch ist.
Die Forscher erzielten ähnliche Ergebnisse, als sie das Transkriptom von let-7-niedrigen und let-7-hohen hämatopoetischen CD34+-Vorläuferzellen (HPCs) untersuchten, die aus menschlichen embryonalen Stammzellen stammen, und zeigten so, dass solche Eigenschaften (thrombopoetische vs. immunmodulatorische MK-Vorläuferzellen) bestimmt sind bereits im HPC-Stadium.
Als sie die imMKCL-Heterogenität auf Einzelzellebene (sc) mittels scRNA-seq weiter untersuchten, wurden fünf transkriptomisch unterschiedliche Zellsubpopulationen identifiziert, von denen zwei hauptsächlich aus let-7-niedrigen imMKCLs bestanden. Eine eingehende Untersuchung der hochregulierten Gene in diesen beiden Zellclustern legt nahe, dass sie wahrscheinlich eine Untergruppe mit funktioneller Dualität (thrombopoetisch und immunmodulatorisch) und eine immunmodulatorische MK-Vorläufer-Untergruppe darstellen.
Durch die Behandlung von imMKCLs mit einem miRNA-let-7a-5p-Inhibitor beobachtete das Forschungsteam eine signifikante Hochregulierung immunbezogener Gene wie PF4, PPBP, ISG15 und IFIT3 in den let-7-niedrigen imMKCL-Zellclustern. Darüber hinaus verstärkte die Hemmung von let-7 die Freisetzung von IL-8, einem proinflammatorischen Zytokin, durch imMKCLs als Reaktion auf die Immunstimulation, was die entscheidende Rolle von let-7 bei der Bestimmung des Schicksals immunmodulatorischer imMKCLs demonstriert.
Die Forscher setzten ihre Untersuchung fort, um zu verstehen, wie let-7 die Bestimmung des MK-Schicksals reguliert, indem sie mittels bioinformatischer Analyse nach potenziellen vorgelagerten Regulatoren suchten, die für die Orchestrierung der transkriptomischen Veränderungen verantwortlich sind, die für die let-7-Zellcluster mit niedrigem imMKCL-Wert spezifisch sind.
Während vorhergesagt wurde, dass Regulatoren, die mit der myeloischen Entwicklung assoziiert sind, wie GATA1 und KLF2, in thrombopoetischen imMKCLs aktiv sind, wurde vorhergesagt, dass IRF7 und IRF3, bekannte Virus-induzierbare Genaktivatoren, in immunmodulatorischen imMKCLs aktiviert werden.
Es wurde vorhergesagt, dass insgesamt 20 vorgeschaltete Regulatoren in beiden Zellclustern aktiv sind, von denen CUX1 und RALB durch Let-7-Hemmung hochreguliert wurden. Bemerkenswerterweise hatte die Überexpression von CUX1 keinen Einfluss auf die Expression von IRF7, ISG15 und IFIT3, während die RALB-Überexpression diese Interferon-Signalgene signifikant hochregulierte. Interessanterweise hatte die RALB-Überexpression jedoch keinen Einfluss auf Gene, die mit der Thrombopoese in Zusammenhang stehen, was darauf hindeutet, dass sie stromabwärts der let-7-miRNA wirkt und speziell immunbezogene Gene in immunmodulatorischen imMKCLs reguliert.
Basierend auf diesem neuen Wissen über let-7-vermittelte Effekte in imMKCLs zeigte das Forschungsteam, dass sowohl genetische als auch pharmakologische RALB-Hemmung die Proliferation und Thrombozytenproduktion von imMKCL verbessern kann.
Durch diese Studie entdeckten die Forscher eine bisher unbekannte regulatorische Achse von let-7-RALB, die zweifellos zur verbesserten industriellen Herstellung von iPSC-PLTs für klinische Anwendungen in der Zukunft beitragen wird.
Mehr Informationen:
Si Jing Chen et al, Eine let-7 microRNA-RALB-Achse verknüpft die Immuneigenschaften von iPSC-abgeleiteten Megakaryozyten mit der Thrombozytenproduktionsfähigkeit, Naturkommunikation (2024). DOI: 10.1038/s41467-024-46605-0