Forscher berichten über intrazelluläre Live-Bildgebung mit neuer, bedingt aktiver Immunfluoreszenz-Sonde

Jüngste Fortschritte in der Bildgebungstechnologie haben es ermöglicht, die intrazelluläre Dynamik zu visualisieren, was ein besseres Verständnis mehrerer wichtiger biologischer Prinzipien zur Beschleunigung der therapeutischen Entwicklung ermöglicht. Fluoreszenzmarkierung ist eine solche Technik, die verwendet wird, um intrazelluläre Proteine, ihre Dynamik und Dysfunktion zu identifizieren. Zu diesem Zweck werden sowohl interne als auch externe Sonden mit Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, obwohl externe Sonden im Vergleich zu internen Sonden intrazelluläre Proteine ​​besser sichtbar machen können. Ihre Anwendung ist jedoch durch die unspezifische Bindung an intrazelluläre Komponenten begrenzt, was zu einer geringen zielspezifischen Signalübertragung und einem höheren Hintergrundrauschen führt.

Kürzlich wurde ein fluoreszenzfarbstoffmarkierter Immunsensor, der als Quenchbody (Q-body) bekannt ist, erfolgreich verwendet, um Antigene in Lösungen oder auf der Zelloberfläche nachzuweisen. Ein Q-Body ist im Wesentlichen ein Antikörperfragment mit der Fähigkeit, ein spezifisches Antigen zu binden.

Vor diesem Hintergrund berichteten Forscher aus Japan und Singapur unter der Leitung von Prof. Hiroshi Ueda vom Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech), Japan, kürzlich über die Anwendbarkeit von Q-bodies für die Bildgebung intrazellulärer Proteine ​​in lebenden Zellen. Ihre Ergebnisse wurden jetzt in veröffentlicht Chemische Wissenschaft.

„Da der Q-Body als ortsspezifisches und antigenabhängiges Bildgebungsinstrument fungiert, stellten wir die Hypothese auf, dass er bei der Interaktion mit dem Zielprotein eine antigenabhängig schaltbare Fluoreszenz zeigen wird, was eine präzise Visualisierung der intrazellulären Dynamik ermöglicht. Wir haben dies durch die Synthese von a demonstriert Q-body für p53, ein Tumorsuppressor-Biomarkerprotein, das eine wichtige Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellteilung und dem Zelltod spielt“, erklärt Prof. Ueda.

Das Team synthetisierte einen „doppelt“ mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Q-Körper namens „C11_Fab Q-Körper“, der im Vergleich zu herkömmlichen Sonden in menschlichen Krebszellen, die p53 exprimieren, eine bessere Empfindlichkeit und Zielspezifität zeigte. Da die Expression von p53 in Krebszellen zunimmt, haben sie den Q-Körper in mehreren menschlichen Krebszelllinien elektroporiert, um ihre Hypothese zu validieren.

Im Vergleich zu einer herkömmlichen Sonde, die selbst in Abwesenheit von p53 kontinuierliche Fluoreszenzsignale zeigte, zeigte die Q-body-Sonde Fluoreszenzsignale in „fixierten“ Zellen (Zellen mit denaturierten Proteinen, um die Zersetzung zu stoppen), die p53 exprimierten. Darüber hinaus konnte die Q-body-Sonde sowohl wildes (Kontrolle) als auch mutantes p53 in fixierten Zellproben sichtbar machen.

Darüber hinaus beobachtete das Team Fluoreszenzsignale mit 8-fach höherer Intensität in lebenden menschlichen Dickdarmkrebs-Zelllinien mit p53-Expression im Vergleich zu den Negativen. Interessanterweise war der Q-Körper langfristig stabil und zeigte Änderungen der Fluoreszenzintensität mit experimentell induzierten Änderungen der p53-Spiegel.

Durchflusszytometrie zeigte eine höhere Immunfluoreszenz mit Q-body in Zellen, die p53 exprimieren. Darüber hinaus waren beim Sortieren das Verhältnis und das Fluoreszenzsignal dieser Zellen im Vergleich zu den anderen (mit oder ohne Q-Körper) signifikant höher.

Prof. Ueda sagt: „Die bestehenden Techniken sind nicht in der Lage, eine präzise Abbildung von weniger häufig vorkommenden intrazellulären Zielen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit zu liefern. In diesem Zusammenhang zeigt unsere Studie das Potenzial von Q-Bodies in der Lebendzell-Bildgebung für eine bessere Visualisierung dynamischer intrazellulärer Veränderungen und bietet einen Ansatz für die intrazelluläre Antigen-spezifische Sortierung lebender Zellen unter Verwendung eines Q-Body.“

Mit Blick auf die Zukunft können wir die Entwicklung vieler weiterer Q-Körper zur Visualisierung mehrerer anderer intrazellulärer Biomarker erwarten, die Türen zu einer verbesserten zellbasierten therapeutischen Entwicklung und Krebsforschung öffnen.