Forscher berichten, dass ein neuer Ansatz die Effizienz der Bearbeitung von Stammzellen mehr als verdoppelt

Ein von der Penn State geleitetes Team interdisziplinärer Forscher hat Techniken entwickelt, um die Effizienz von CRISPR-Cas9 zu verbessern, der Genome-Editing-Technik, die 2020 den Nobelpreis erhielt. CRISPR-Cas9 ist zwar schneller, kostengünstiger und genauer als andere Gen-Editing-Verfahren Methoden, so Projektleiter Xiaojun „Lance“ Lian, außerordentlicher Professor für Biomedizintechnik und Biologie an der Penn State, hat die Technologie Grenzen – insbesondere bei Anwendungen zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit.

Die Forscher entwickelten ein effizienteres und zugänglicheres Verfahren zur Anwendung von CRISPR-Cas9-Systemen in humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), die von staatlich zugelassenen Stammzelllinien stammen, was laut Lian die Diagnostik und Behandlung genetischer Störungen erheblich voranbringen könnte. Der Ansatz wurde am 7. September veröffentlicht Cell Reports-Methoden.

CRISPR-Cas9, das für Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated Protein 9 steht, gibt Wissenschaftlern die Möglichkeit, auf präzise Stellen des genetischen Codes abzuzielen, um die DNA zu verändern, und bietet Möglichkeiten, neue Diagnosewerkzeuge zu entwickeln und möglicherweise Mutationen zu korrigieren, um genetische Ursachen zu behandeln von Krankheit.

„Das menschliche Genom ist enorm, und CRISPR-Cas9 ermöglicht es Wissenschaftlern, ein mutiertes Gen zu finden und gezielt zu untersuchen, um es zu untersuchen“, sagte Lian.

CRISPR verwendet eine Scheibe aus genetischem Material, die als Plasmid-DNA bekannt ist, um gesteuerte Ribonukleinsäure (RNA) zu liefern, die das Cas9-Enzym genau an der Stelle des Zielgens positioniert. Wenn die DNA lokalisiert ist, bindet Cas9 daran und schneidet sie heraus, sodass andere DNA den Schnitt reparieren kann. Die Forscher können dann sehen, wie die Entfernung die Expression des Gens verändert. Laut Lian gibt es jedoch Probleme mit der Liefer- und Bearbeitungseffizienz bei aktuellen DNA-basierten CRISPR-Methoden.

„Die Lieferung von DNA-CRISPR-Effektoren ist gering“, sagte er. „Nur 20 % bis 30 % der Zielzellen erhalten Gen-editierende DNA, wenn CRISPR verwendet wird. Die Zufuhr von RNA in Zellen kann effizienter sein; wenn jedoch normale RNA eingeführt wird, können Zellen sie als Virus sehen. Sie zerstören die RNA, bevor sie Proteine ​​herstellen kann – sagen wir in wenigen Stunden – und damit den Gen-Editing-Versuch zunichte machen kann.“

Um das Ergebnis zu verbessern, änderten die Forscher die Art und Weise, wie die Genombearbeitungswerkzeuge an die Stammzellen geliefert werden, indem sie modifizierte RNA (modRNA) verwendeten. Die modRNA unterscheidet sich von Plasmid-DNA dadurch, dass sie eines der in RNA gefundenen Basissubstrate durch eine chemisch modifizierte Version ersetzt und durch eine stärkere strukturelle Unterstützung stabilisiert wird.

„Die modRNA erwies sich als deutlich effizienter als Plasmid-DNA“, sagte Lian. „Rund 90 % der Zellen erhielten die modRNA aus einer einfachen Transfektion, sodass sie an Ort und Stelle bleiben und ihre Aufgabe erfüllen konnte.“

Die Forscher fanden auch heraus, dass die Zeitdauer, in der die modRNA vorhanden war, ideal war: lang genug, um die Zellen zu modifizieren, aber nicht so lange, dass sie eine Off-Target-Aktivität verursachte. Laut Lian führte modRNA jedoch zu einem weiteren Problem.

Wenn modRNA Cas9 erfolgreich an das Zielgen geliefert wird, erzeugt es einen doppelsträngigen Bruch im Genom, den einige Zellen zu reparieren versuchen. Diejenigen, die sich selbst reparieren, können die Reparatur oder „Mutation“ an ihre Nachkommen weitergeben. Dies ist der Prozess, den Forscher besser verstehen wollen, also sind dies die Zellen, die sie ernten und untersuchen wollen. Das Problem, sagte Lian, ist, dass die meisten Zellen mit diesem Bruch es als ein großes Problem mit dem Genom identifizieren und sich selbst zerstören, anstatt zu versuchen, sich selbst zu reparieren.

Um die toxischen Nebenwirkungen von Cas9 zu reduzieren und bearbeiteten Zellen beim Überleben zu helfen, führte Lians Team ein kleines Protein ein, von dem bekannt ist, dass es das Zellwachstum unterstützt. Laut Lian hemmte dieses hinzugefügte Protein den Zelltod und verbesserte die Bearbeitungseffizienz von Cas9 um bis zu 84 %.

Die Forscher fanden auch heraus, dass die modRNA andere Gen-Editing-Techniken verbessern könnte, wie zum Beispiel das Base Editing. Die Basenbearbeitung kann Gene ausschalten oder Mutationen im Genom korrigieren, indem ein Protein verwendet wird, um ein einzelnes Nukleotid zu ändern, anstatt beide Stränge zu schneiden, wie es CRISPR tut.

„Wir transfizierten Stammzellen entweder mit einem Plasmid-basierten oder einem modRNA-basierten Base-Editing-Protein“, sagte Lian. „Unsere modRNA-basierte Methode war mit 68 % mehr als viermal effizienter als die Plasmid-basierte Technik mit etwa 16 % bei der erfolgreichen Bearbeitung des Genoms.“

Laut Lian werden die Forscher in der Lage sein, Gene und ihre Funktionen schneller besser zu verstehen, wenn mehr Gen-Editing-Labors die Effizienz und Effektivität der Gen-Editierung verbessern.

„Der menschliche Körper hat mehr als 20.000 Gene, aber wir untersuchen die Funktionen von nur etwa 10 % von ihnen“, sagte Lian. „Die Untersuchung des Zwecks jedes verbleibenden Gens, eines nach dem anderen, könnte ein Leben lang dauern. Die Verwendung künstlich hergestellter Stammzellen aus unseren hocheffizienten Gen-Editing-Techniken kann diesen Prozess erheblich beschleunigen.“