Synthetische Biologen der Rice University und der Princeton University haben eine „Live-Reporter“-Technologie demonstriert, die die Funktionsweise von Netzwerken von Signalproteinen in lebenden Zellen weitaus präziser aufdecken kann als aktuelle Methoden. Das einzigartige Reporting-Tool kann beispielsweise zeigen, wie schnell Signalnetzwerke reagieren und wie ihre Reaktionen von Zelle zu Zelle zeitlich und räumlich variieren.
Die Forscher haben das Werkzeug mithilfe unauffälliger Proteine entwickelt, die einen essentiellen Signalmechanismus nutzen, den menschliche Zellen nutzen, um Wachstum, Differenzierung, Migration, Entzündung und andere Prozesse zu regulieren.
In der Studie, die kürzlich im Open-Access-Journal veröffentlicht wurde eLifeDas Rice-Princeton-Team demonstrierte seinen modularen Ansatz zur Markierung von Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) mit Reporterproteinen, die grün fluoreszierende Proteine aktivieren, wenn ihre RTK-Partner phosphoryliert werden.
Kinasen sind Enzyme, die das Verhalten anderer Proteine verändern können, indem sie Phosphatgruppen anheften oder ablösen, ein Prozess, der Phosphorylierung genannt wird. RTKs sind spezialisierte Kinasen, die selbst phosphoryliert werden, wenn sie eingehende Signale oder Reize außerhalb der Zelle erkennen, und dann lebenswichtige Zellfunktionen regulieren.
Das Team zeigte, dass das „Live-Reporter“-System mit einem Mikroskop verwendet werden kann, um eine Videoaufzeichnung der Signalnetzwerkaktivität in lebenden Zellen zu erstellen. Wo Zellen leuchten und wie hell, verrät den Ort und die Intensität der Signalnetzwerkreaktion, sagte Caleb Bashor, Mitautor der Studie und Assistenzprofessor für Bioingenieurwesen und Biowissenschaften an der Rice University.
Zeitraffer von iRFP-ZtSH2 in NIH3T3-Zellen, die iRFP-ZtSH2 und EGFR-CD3ε-FusionRed koexprimieren. Die Zellen wurden zunächst mit EGF (100 ng/ml) und dann zu den im Video angegebenen Zeiten mit Gefitinib (10 µM) behandelt. Kredit: eLife (2023). DOI: 10.7554/eLife.82863
„Wenn man Dinge untersucht, die innerhalb von Zellen passieren, wie Signalnetzwerke oder Gennetzwerke, muss man die Zellen meistens zerstören, um ihren Inhalt zu untersuchen“, sagte Bashor. „Jedes Mal, wenn man etwas bauen kann, bei dem die Zellen am Leben bleiben und man in Echtzeit beobachten kann, wie das Signalnetzwerk innerhalb der Zelle funktioniert, ist das ein großer Vorteil.“
Die Forscher nannten die Reporter pYtags, in Anlehnung an die biochemische Nomenklatur, in der Tyrosin als „Y“ und als „pY“ bezeichnet wird, wenn es phosphoryliert ist.
Bashor und Xiaoyu Yang, ein Ph.D. Student in Bashors Forschungsgruppe, entwickelte pYtags in Zusammenarbeit mit den Forschungsgruppen von Jared Toettcher und Celeste Nelson aus Princeton. Die Studie zeigte, dass das System die Aktivität von RTKs, sogenannten Wachstumsfaktorrezeptoren, in menschlichen Fibroblastenzellen aufzeichnen kann.
„Wir nehmen ein manipuliertes Protein, das Teil eines anderen Systems ist – es ist eigentlich Teil der Immunsignalisierung – und stellen es in diesen neuen Kontext, nämlich Fibroblastenzellen, mit denen Jared in seinem Labor in Princeton arbeitet“, sagte Bashor. „Wir glauben, dass es wahrscheinlich nicht mit irgendetwas anderem in der Zelle interagiert, weil es von einem völlig anderen Zelltyp ist. Es hängt also einfach am Ende des Wachstumsfaktorrezeptors.“
Der pYtag-Reporter ist so konzipiert, dass er gemeinsam mit seinem RTK-Partner aktiviert wird und eine proportionale Menge an Fluoreszenz auslöst. Je stärker also die RTK-Reaktion ist, desto heller leuchtet die Zelle, wenn man sie durch ein Mikroskop betrachtet.
„Es kann dieses Phosphorylierungssignal vom Wachstumsfaktorrezeptor empfangen“, sagte Bashor. „Wenn also der Rezeptor aktiviert wird, dringt das grün fluoreszierende Protein ein, bindet sich an etwas in der Nähe der Membran, und Sie erhalten etwas, das wie dieser grüne Ring um die Außenseite der Zelle aussieht. Das sagt Ihnen in Echtzeit, wann …“ Zellen sehen den Wachstumsfaktor und wie schnell sich der Signalweg einschaltet.“
Bashor sagte, pYtags könnten zur Überwachung vieler Arten von Tyrosinkinase-Rezeptoren verwendet werden.
„Wir zeigen in der Arbeit, dass dieser Reporter auf mehrere verschiedene Wachstumsfaktor-Rezeptortypen angewendet werden kann und dass er als Reporter für alle von ihnen verwendet werden könnte“, sagte er. „Dies ist ein Fenster in die Dynamik der zellulären Signalübertragung, das wir vorher wirklich nicht hatten.“
Mehr Informationen:
Payam E Farahani et al., pYtags ermöglichen räumlich-zeitliche Messungen der Rezeptortyrosinkinase-Signalübertragung in lebenden Zellen, eLife (2023). DOI: 10.7554/eLife.82863