Erweiterungstechnik zur Abbildung nanoskaliger Strukturen in Zellen macht hochauflösende Bildgebung zugänglicher

Ein klassischer Weg, nanoskalige Strukturen in Zellen abzubilden, sind leistungsstarke, teure Superauflösungsmikroskope. Als Alternative haben MIT-Forscher eine Möglichkeit entwickelt, Gewebe vor der Abbildung zu vergrößern – eine Technik, die es ihnen ermöglicht, mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop eine Auflösung im Nanomaßstab zu erreichen.

Mit der neuesten Version dieser Technik ist es den Forschern gelungen, Gewebe in einem einzigen Schritt um das 20-fache zu vergrößern. Diese einfache, kostengünstige Methode könnte nahezu jedem Biologielabor den Weg für die Durchführung nanoskaliger Bildgebung ebnen.

„Das demokratisiert die Bildgebung“, sagt Laura Kiessling, Novartis-Professorin für Chemie am MIT und Mitglied des Broad Institute of MIT and Harvard sowie des Koch Institute for Integrative Cancer Research des MIT.

„Wenn man ohne diese Methode Dinge mit hoher Auflösung sehen möchte, muss man sehr teure Mikroskope verwenden. Mit dieser neuen Technik können Sie Dinge sehen, die Sie normalerweise mit Standardmikroskopen nicht sehen könnten Kosten für die Bildgebung, da man nanoskalige Dinge sehen kann, ohne dass eine spezielle Einrichtung erforderlich ist.“

Mit der mit dieser Technik erreichten Auflösung von etwa 20 Nanometern können Wissenschaftler Organellen im Inneren von Zellen sowie Proteincluster erkennen.

„Eine zwanzigfache Erweiterung bringt Sie in den Bereich, in dem biologische Moleküle agieren. Die Bausteine ​​des Lebens sind nanoskalige Dinge: Biomoleküle, Gene und Genprodukte“, sagt Edward Boyden, Y. Eva Tan-Professor für Neurotechnologie am MIT; ein Professor für Biotechnik, Medienkunst und -wissenschaften sowie Gehirn- und Kognitionswissenschaften; ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute; und Mitglied des McGovern Institute for Brain Research des MIT und des Koch Institute for Integrative Cancer Research.

Boyden und Kiessling sind die leitenden Autoren der neuen Studie, die in erscheint Naturmethoden. MIT-Doktorand Shiwei Wang und Tay Won Shin Ph.D. sind die Hauptautoren des Artikels.

Eine einzelne Erweiterung

Boydens Labor erfand 2015 die Expansionsmikroskopie. Die Technik erfordert das Einbetten von Gewebe in ein absorbierendes Polymer und das Aufbrechen der Proteine, die das Gewebe normalerweise zusammenhalten. Bei Zugabe von Wasser quillt das Gel und zieht Biomoleküle auseinander.

Die ursprüngliche Version dieser Technik, die das Gewebe um etwa das Vierfache vergrößerte, ermöglichte es den Forschern, Bilder mit einer Auflösung von etwa 70 Nanometern zu erhalten. Im Jahr 2017 modifizierte Boydens Labor den Prozess um einen zweiten Expansionsschritt und erreichte so eine insgesamt 20-fache Expansion. Dies ermöglicht eine noch höhere Auflösung, allerdings ist der Prozess komplizierter.

„Wir haben in der Vergangenheit mehrere 20-fache Expansionstechnologien entwickelt, aber sie erfordern mehrere Expansionsschritte“, sagt Boyden. „Wenn man diese Erweiterung in einem einzigen Schritt durchführen könnte, könnte das die Dinge erheblich vereinfachen.“

Bei 20-facher Vergrößerung können Forscher mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop eine Auflösung von etwa 20 Nanometern erreichen. Dadurch können sie Zellstrukturen wie Mikrotubuli und Mitochondrien sowie Proteincluster erkennen.

In der neuen Studie wollten die Forscher eine 20-fache Expansion mit nur einem einzigen Schritt durchführen. Das bedeutete, dass sie ein Gel finden mussten, das sowohl extrem saugfähig als auch mechanisch stabil ist, damit es bei einer 20-fachen Ausdehnung nicht auseinanderfällt.

Um dies zu erreichen, verwendeten sie ein Gel, das aus N,N-Dimethylacrylamid (DMAA) und Natriumacrylat zusammengesetzt war. Im Gegensatz zu früheren Expansionsgelen, die auf der Zugabe eines weiteren Moleküls beruhen, um Vernetzungen zwischen den Polymersträngen zu bilden, bildet dieses Gel spontan Vernetzungen und weist starke mechanische Eigenschaften auf.

Solche Gelkomponenten wurden zuvor in Expansionsmikroskopieprotokollen verwendet, die resultierenden Gele konnten sich jedoch nur etwa um das Zehnfache ausdehnen. Das MIT-Team optimierte das Gel und den Polymerisationsprozess, um das Gel robuster zu machen und eine 20-fache Expansion zu ermöglichen.

Um das Gel weiter zu stabilisieren und seine Reproduzierbarkeit zu verbessern, entfernten die Forscher vor der Gelierung Sauerstoff aus der Polymerlösung, wodurch Nebenreaktionen verhindert werden, die die Vernetzung beeinträchtigen. Bei diesem Schritt muss Stickstoffgas durch die Polymerlösung geleitet werden, wodurch der größte Teil des Sauerstoffs im System ersetzt wird.

Sobald sich das Gel gebildet hat, werden ausgewählte Bindungen in den Proteinen, die das Gewebe zusammenhalten, aufgebrochen und Wasser wird hinzugefügt, damit sich das Gel ausdehnt. Nach der Expansion können Zielproteine ​​im Gewebe markiert und abgebildet werden.

„Dieser Ansatz erfordert möglicherweise mehr Probenvorbereitung im Vergleich zu anderen hochauflösenden Techniken, ist aber viel einfacher, wenn es um den eigentlichen Bildgebungsprozess geht, insbesondere bei der 3D-Bildgebung“, sagt Shin. „Wir dokumentieren das Schritt-für-Schritt-Protokoll im Manuskript, damit die Leser es leicht durchgehen können.“

Abbildung winziger Strukturen

Mit dieser Technik konnten die Forscher viele winzige Strukturen in Gehirnzellen abbilden, darunter auch Strukturen, die als synaptische Nanosäulen bezeichnet werden. Hierbei handelt es sich um Proteincluster, die in einer bestimmten Weise an neuronalen Synapsen angeordnet sind und es den Neuronen ermöglichen, über die Sekretion von Neurotransmittern wie Dopamin miteinander zu kommunizieren.

In Studien an Krebszellen bildeten die Forscher auch Mikrotubuli ab – hohle Röhren, die den Zellen ihre Struktur verleihen und eine wichtige Rolle bei der Zellteilung spielen. Sie konnten auch Mitochondrien (Organellen, die Energie erzeugen) und sogar die Organisation einzelner Kernporenkomplexe (Proteincluster, die den Zugang zum Zellkern kontrollieren) erkennen.

Wang verwendet diese Technik nun, um Kohlenhydrate, sogenannte Glykane, abzubilden, die auf Zelloberflächen vorkommen und dabei helfen, die Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung zu steuern. Diese Methode könnte auch zur Abbildung von Tumorzellen verwendet werden, sodass Wissenschaftler viel einfacher als bisher einen Einblick in die Organisation von Proteinen in diesen Zellen erhalten könnten.

Die Forscher gehen davon aus, dass jedes Biologielabor in der Lage sein sollte, diese Technik zu geringen Kosten einzusetzen, da sie auf handelsübliche Standardchemikalien und gängige Ausrüstung wie konfokale Mikroskope und Handschuhtaschen angewiesen ist, die die meisten Labore bereits haben oder leicht darauf zugreifen können.

„Wir hoffen, dass mit dieser neuen Technologie jedes konventionelle Biologielabor dieses Protokoll mit seinen vorhandenen Mikroskopen nutzen kann und so eine Auflösung erreichen kann, die nur mit sehr speziellen und teuren Mikroskopen auf dem neuesten Stand der Technik erreicht werden kann“, sagt Wang .

Diese Geschichte wurde mit freundlicher Genehmigung von MIT News erneut veröffentlicht (web.mit.edu/newsoffice/), eine beliebte Website mit Neuigkeiten über MIT-Forschung, Innovation und Lehre.