Erste Struktur des wichtigsten COVID-Enzyms bei menschlicher Körpertemperatur

Wissenschaftler, die ein COVID-19-Coronavirus-Enzym bei Temperaturen von frostig bis körperwarm untersuchten, entdeckten subtile strukturelle Veränderungen, die Hinweise darauf geben, wie das Enzym funktioniert. Die Ergebnisse, veröffentlicht in IUCrJdie Zeitschrift der International Union of Crystallography, könnte die Entwicklung neuer Medikamente zur Bekämpfung von COVID-19 anregen – und möglicherweise dazu beitragen, zukünftige Coronavirus-Pandemien abzuwenden.

„Keine frühere Studie hat dieses wichtige Coronavirus-Enzym bei physiologischer (oder Körper-) Temperatur untersucht“, sagte Daniel Keedy, ein Strukturbiologe an der City University of New York (CUNY), der die Studie in Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern des US-Departments durchführte des Brookhaven National Laboratory von Energy.

Bis heute stammen die meisten Strukturen aus gefrorenen Proben – weit entfernt von den Temperaturen, bei denen die Moleküle in lebenden Zellen arbeiten. „Wenn Sie bei physiologischer Temperatur arbeiten, sollten Sie sich ein realistischeres Bild davon machen, was während einer tatsächlichen Infektion passiert, denn dort spielt sich die Biologie ab“, sagte Keedy.

Außerdem, fügte er hinzu, nutzte das Team die Temperatur als Werkzeug. „Indem wir an diesem Knopf drehen und sehen, wie das Protein reagiert, können wir etwas über seine Mechanik lernen – wie es physikalisch funktioniert.

Die Struktur von Mpro entschlüsseln

Das fragliche Protein ist die Hauptprotease (Mpro) von SARS-CoV-2, dem Virus, das COVID-19 verursacht. Wie alle Proteasen ist es ein Enzym, das andere Proteine ​​zerschneidet. Bei vielen Virusinfektionen, einschließlich COVID-19, produzieren infizierte Zellen zunächst die funktionellen Proteine ​​eines Virus als eine einzige verbundene Proteinkette. Proteasen schneiden die Stücke auseinander, damit sich die einzelnen Proteine ​​zu neuen Kopien des Virus zusammensetzen können. Die Suche nach einem Medikament zur Deaktivierung von Mpro könnte COVID-19 bremsen.

Um die Struktur des Enzyms zu untersuchen, verwendeten die Forscher eine Technik namens Röntgenkristallographie an der National Synchrotron Light Source II (NSLS-II) des Brookhaven Lab. NSLS-II ist eine Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, die helle Röntgenstrahlen erzeugt. Wenn man diese Röntgenstrahlen auf eine kristallisierte Probe eines biologischen Moleküls richtet, kann man die dreidimensionale Anordnung der Atome erkennen, aus denen das Molekül besteht.

Das Untersuchen von Proben, die nicht gefroren sind, kann eine Herausforderung sein.

„Je höher die Temperatur, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Röntgenstrahlen den Kristall beschädigen“, erklärte der Co-Autor der Studie, Babak Andi, der die Strahllinie Frontier Macromolecular Crystallography (FMX) von NSLS-II betreibt.

„Um den Schaden zu minimieren, drehen und bewegen wir den Kristall linear, während er sich durch die Röntgenstrahlen bewegt. Dadurch wird die Röntgendosis über die gesamte Länge des Kristalls verteilt“, sagte er.

Er bemerkte, dass die geringe Größe des Röntgenstrahls bei NSLS-II es ermöglicht, den Strahl selbst auf die kleinste Abmessung des Kristalls zu fokussieren – eine Kante, die 10 bis 20 Millionstel Meter oder kleiner misst – während er rotiert.

„Darüber hinaus arbeiten der FMX-Detektor und andere Systeme so schnell, dass wir einen vollständigen Datensatz in nur 10 bis 15 Sekunden pro Probe sammeln können, und zwar mit ausreichender Qualität, um eine Struktur aufzuklären, bevor es zu erheblichen Röntgenschäden kommt.“

Von gefroren bis physiologisch

Die Wissenschaftler verwendeten FMX, um die allererste Serie von Mpro-Kristallographiedaten bei fünf verschiedenen Temperaturen zu sammeln, die von kryogenen (-280 Grad Fahrenheit) bis zu dem reichen, was in der Röntgenkristallographie oft als „Raumtemperatur“ bezeichnet wird (~39 °F ) auf physiologisch (98°F). Sie untersuchten auch den Kristall bei Raumtemperatur unter hoher Luftfeuchtigkeit. Dann speisten sie die Daten in eine spezielle Art von Computersimulation ein, um viele mögliche Anordnungen auf atomarer Ebene unter allen Bedingungen zu identifizieren.

Die Ergebnisse zeigten subtile Konformationsänderungen, einschließlich einer erhöhten Flexibilität in Teilen des Proteins bei höheren Temperaturen. Das Team sah auch einige Merkmale, die für das Enzym unter physiologischen Bedingungen einzigartig waren.

Die meisten Veränderungen fanden nicht direkt im „aktiven Zentrum“ des Enzyms statt – dem Teil, der direkt am Schneiden anderer Proteine ​​beteiligt ist. Stattdessen befanden sie sich in Teilen des Enzyms, die weiter von dieser Stelle entfernt waren. Aber die Daten deuten darauf hin, dass diese entfernten Orte das aktive Zentrum durch eine Art Fernsteuerungsmechanismus beeinflussen könnten, der in biologischen Systemen üblich ist, sagte Keedy. Das Deaktivieren selbst dieser entfernten Orte könnte möglicherweise die Funktion des Enzyms blockieren.

„Man kann sich Mpro als eine Art gefaltetes Band vorstellen, das aus zwei identischen Hälften besteht (die Dimere bilden), die sich symmetrisch verbinden, ähnlich wie ein Händedruck“, sagte Keedy. Das Zentrum dieser Handshake-Region (die „Dimer-Grenzfläche“) ist über eine flexible Loop-Region des Proteins mit dem aktiven Zentrum verbunden.

Wie Keedy erklärte, stellten die Wissenschaftler fest, dass sich bei höheren Temperaturen „der Griff des ‚Handschlags‘ ändert – die beiden Komponenten passen ihren Griff ein wenig an Kommunikation über diese Schleife zwischen der Dimer-Schnittstelle und dem aktiven Zentrum“, sagte Keedy.

Der Weg zum Wirkstoffdesign

„Wir sehen in dieser Studie subtile Veränderungen in der Struktur, aber das Medikamentendesign hängt von subtilen Veränderungen ab – weniger als ein Milliardstel Meter hier, weniger als ein Milliardstel Meter dort“, bemerkte Keedy.

Andere Studien haben gezeigt, dass kleine arzneimittelähnliche Moleküle an einigen entfernten Stellen, die in dieser neuen Arbeit identifiziert wurden, an das Enzym binden können.

„Wenn wir diese Moleküle perfektionieren, optimieren, ausarbeiten und optimieren könnten, könnten wir möglicherweise einen neuen Halt finden, um die Funktion des Enzyms zu verändern – nicht am aktiven Zentrum, wie es im Wesentlichen alle antiviralen Mittel für dieses Protein sind derzeit zielgerichtet, aber auf einer anderen Website durch einen anderen Mechanismus“, sagte Keedy. „Unsere Ergebnisse haben uns dazu inspiriert, diese Idee zu erforschen.“

Die Rolle des Wassers

Die Untersuchung des Enzyms bei erhöhter Luftfeuchtigkeit ahmt auch die physiologischen Bedingungen in wassergefüllten Zellen nach – und kann zusätzliche Hinweise für das Arzneimitteldesign liefern.

„Für diese Studien stülpen wir, nachdem wir den zu untersuchenden Kristall ausgewählt haben, eine spezielle Hülle darüber, um ihn vor dem Austrocknen zu bewahren“, sagte Babak Andi von NSLS-II. „Wenn wir die Probe dann zur Röntgendatenerfassung in die Strahlführung legen, entfernen wir die Hülse und blasen einen kontinuierlichen Luftstrom mit 99,5 % Luftfeuchtigkeit über den Kristall, während wir die Daten erfassen.“

Die Ergebnisse zeigten spezifische Wassermoleküle, die nur unter Bedingungen hoher Luftfeuchtigkeit lose an das Enzym binden, einschließlich eines in der Nähe des aktiven Zentrums.

„Diese Wassermoleküle geben Ihnen einen Hinweis darauf, wo Hemmstoffe binden könnten“, sagte Andi.

Seine Gruppe hat eine Reihe potenzieller arzneimittelähnlicher Moleküle untersucht, die schwach gebundene Wassermoleküle zu ersetzen scheinen, wenn sie in der Nähe des aktiven Zentrums von Mpro binden. Über diese Arbeit wird in berichtet eine kürzlich erschienene Arbeit in Wissenschaftliche Berichte aus dem Zeitschriftenportfolio von Nature.

Beide Wissenschaftler waren dankbar für den kooperativen Geist des gesamten Teams, zu dem weitere Wissenschaftler sowohl am Brookhaven Lab und CUNY als auch von Diamond Light Source im Vereinigten Königreich gehörten.

„Es war sehr wichtig, dass die Zusammenarbeit aus der Ferne möglich war, um dieses Projekt zum Laufen zu bringen, bei dem wir Mitarbeiter vor Ort an der Beamline und Mitarbeiter außerhalb des Standorts hatten, die die Computermodellierung durchführen konnten“, sagte Keedy. „Es ist ein Beispiel von vielen während der Pandemie, in der die wissenschaftliche Gemeinschaft zusammenkommt.“