Enzyme und Proteine ​​arbeiten zusammen, um die Enden der DNA in sich teilenden Zellen aufzuräumen

Forscher der University of Wisconsin-Madison haben beschrieben, wie ein Enzym und Proteine ​​interagieren, um die Schutzkappen, Telomere genannt, am Ende der Chromosomen aufrechtzuerhalten, ein neuer Einblick, wie eine menschliche Zelle die Integrität ihrer DNA durch wiederholte Zellteilung bewahrt .

Die DNA-Replikation ist für die Aufrechterhaltung des Lebens, wie wir es kennen, unerlässlich, aber viele der Komplexitäten des Prozesses – wie unzählige Biomoleküle dorthin gelangen, wo sie hin müssen, und über eine Reihe von kompliziert orchestrierten Schritten interagieren – bleiben mysteriös.

„Die Mechanismen hinter der Funktionsweise dieses Enzyms namens Polα-Primase waren jahrzehntelang schwer zu fassen“, sagt Ci Ji Lim, Assistenzprofessor für Biochemie und Hauptforscher für neue Forschungsergebnisse zur DNA-Replikation, die kürzlich in veröffentlicht wurden Natur. „Unsere Studie liefert einen großen Durchbruch beim Verständnis der DNA-Synthese an den Enden von Chromosomen und generiert neue Hypothesen darüber, wie die Polα-Primase – ein zentrales Rädchen in der DNA-Replikationsmaschine – funktioniert.“

Jedes Mal, wenn sich eine Zelle teilt, verkürzen sich die Telomere am Ende des langen DNA-Moleküls, aus dem ein einzelnes Chromosom besteht, leicht. Telomere schützen Chromosomen wie ein Nagel das Ende eines Schnürsenkels. Schließlich sind die Telomere so kurz, dass der lebenswichtige genetische Code auf einem Chromosom freigelegt wird und die Zelle, die nicht normal funktionieren kann, in einen Zombie-Zustand eintritt. Ein Teil der routinemäßigen Wartung einer Zelle umfasst das Verhindern einer übermäßigen Verkürzung, indem diese DNA mit Polα-Primase wieder aufgefüllt wird.

An der Telomerbaustelle baut die Polα-Primase zunächst einen kurzen Nukleinsäure-Primer (genannt RNA) und verlängert diesen Primer dann mit DNA (dann RNA-DNA-Primer genannt). Die Wissenschaftler dachten, die Polα-Primase müsste ihre Form ändern, wenn sie von der RNA- zur DNA-Molekülsynthese wechselt. Lims Labor fand heraus, dass Polα-Primase den RNA-DNA-Primer an Telomeren unter Verwendung eines starren Gerüsts mit Hilfe eines anderen Rädchens in der Telomer-Replikationsmaschine, einem akzessorischen Protein namens CST, herstellt. CST wirkt wie ein Stop-and-Go-Schild, das die Aktivität anderer Enzyme stoppt und Polα-Primase auf die Baustelle bringt.

„Vor dieser Studie mussten wir uns vorstellen, wie die Polα-Primase funktioniert, um die Telomerreplikation an den Enden der Chromosomen abzuschließen“, sagt Lim. „Jetzt haben wir hochauflösende Strukturen von Polα-Primase, die an einen akzessorischen Proteinkomplex namens CST gebunden sind. Wir fanden heraus, dass CST nach Bindung an den Matrizen-DNA-Strang am Telomer die Wirkung von Polα-Primase erleichtert. CST schafft die Voraussetzungen dafür, dass Polα-Primase zuerst RNA und dann DNA unter Verwendung einer einheitlichen architektonischen Plattform synthetisiert.“

Die Forscher bekamen auch einen Einblick, wie die Polα-Primase die DNA-Synthese an anderer Stelle entlang der Länge eines Chromosoms initiieren könnte. Andere Wissenschaftler haben den CST-pol-α-Primase-Komplex auch an Stellen gefunden, an denen DNA-Schäden repariert werden und wo die DNA-Replikation ins Stocken geraten ist.

„Da die Polα-Primase eine zentrale und sehr wichtige Rolle bei der DNA-Replikation in Telomeren und anderswo entlang der Chromosomen spielt – es ist das einzige Enzym, das Primer auf DNA-Matrizen von Grund auf für die DNA-Replikation herstellt – bietet unsere CST-Polα-Primase-Struktur neue Einblicke in die Art und Weise Die Polα-Primase kann ihre Aufgabe auch während der genomischen DNA-Replikation erfüllen“, sagt Lim. „Es ist eine sehr elegante Lösung, die die Natur entwickelt hat, um diesen komplizierten Prozess zu bewerkstelligen.“

„Unsere Ergebnisse zeigen eine beispiellose Rolle, die CST bei der Erleichterung dieser Polα-Primase-Aktivität spielt“, erklärt Erstautor Qixiang He, ein Doktorand im Graduiertenprogramm für Biophysik der UW-Madison. „Es wird interessant sein zu sehen, ob akzessorische Faktoren, die an anderer Stelle auf Chromosomen an der DNA-Replikation beteiligt sind, die Polα-Primase auf die gleiche Weise aufbauen wie CST für Telomere.“

Die Forscher erstellten das Strukturmodell der CST-Polα-Primase mithilfe einer fortschrittlichen Bildgebungstechnik namens Kryo-Elektronenmikroskopie-Einzelpartikelanalyse. Bei der Kryo-EM werden schnell gefrorene Proben in einem dünnen Eisfilm suspendiert und dann mit einem Transmissionselektronenmikroskop abgebildet, was zu hochauflösenden 3D-Modellen von Biomolekülen wie den Enzymen führt, die bei der DNA-Replikation arbeiten.

Das Team von Lim verwendete Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse, um zunächst die Struktur der CST-Polα-Primase zu bestimmen und sich dann darauf zu konzentrieren, bewegliche Teile des Komplexes detaillierter zu visualisieren. Sie sammelten Daten am UW-Madison Cryo-Electron Microscopy Research Center (CEMRC), das im UW-Madison Department of Biochemistry untergebracht ist, und der NCI-finanzierten National Cryo-Electron Microscopy Facility am Frederick National Laboratory for Cancer Research.

„Wir begannen mit einem Rätsel aus unserem biochemischen Assay, aber als wir den CST-Pol-α-Primase-Co-Komplex abbildeten und seine Kryo-EM-Strukturen sahen, wurde alles sofort klar. Das war für alle im Team äußerst zufriedenstellend. Darüber hinaus Daher liefern die Strukturen auch Ideen, die wir jetzt mit Experimenten testen können“, sagt Xiuhua Lin, Laborleiter und Co-Autor der neuen Studie.

Zu diesen Ideen gehört es, detaillierter zu erfassen, wie CST-pol-α/Primase funktioniert. Die Forscher wollen auch den gesamten menschlichen Telomerreplikationsprozess kartieren und untersuchen, wie CST-pol-α/Primase seine Aktivität beendet, sobald die DNA an Telomeren kopiert wurde.

„Man kann nicht wirklich studieren, wie sich ein Auto bewegt, indem man sich seine Einzelteile ansieht – man muss die Teile zusammenbauen und beobachten, wie sie zusammenarbeiten. Aber biomolekulare Maschinen haben oft so viele bewegliche Teile, dass es schwierig sein kann, sie zu untersuchen“, sagt Lim sagt. „Hier kommen die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der Kryo-Elektronenmikroskopie-Einzelpartikelanalyse ins Spiel. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, ein hochauflösendes Atommodell zusammenzustellen und lieferte entscheidende Einblicke in seine Bewegung, was wiederum unser Verständnis dafür erleichterte, wie die menschliche CST-Polα-Primase funktioniert.“