Enzyme, die im Capybara-Darm entdeckt wurden, könnten die Verwertung agroindustrieller Abfälle beschleunigen

Die Umwandlung agroindustrieller Abfälle in für die Gesellschaft interessante Moleküle wie Biokraftstoffe und Biochemikalien ist eine der Möglichkeiten, die Abhängigkeit von Öl und anderen fossilen Brennstoffen zu verringern. Als einer der weltweit größten Produzenten von pflanzlicher Biomasse ist Brasilien gut positioniert, um diesen Übergang anzuführen, aber lignozellulosehaltige Rohstoffe (die Lignin, Hemizellulose und Zellulose enthalten) sind schwer zu dekonstruieren oder (technischer ausgedrückt) widerspenstig gegenüber mikrobiellem und enzymatischem Abbau .

Wissenschaftler in Brasilien schauen in die Natur, um herauszufinden, wie Strategien zur Erhöhung der Verfügbarkeit der in diesen Materialien enthaltenen Zucker ihre Depolymerisation verbessern können. In Campinas (Bundesstaat São Paulo) führte eine Forschungsgruppe am Brazilian Biorenewables National Laboratory (LNBR), einem Zweig des Brasilianischen Zentrums für Energie- und Materialforschung (CNPEM), eine interdisziplinäre Studie mit Omics (Genomics, Proteomics, Metabolomics, etc.) und Synchrotronlicht und entdeckten zwei neue Familien von Enzymen mit biotechnologischem Potenzial, die von Mikroorganismen im Darm von Capybaras produziert werden.

Beide Enzymfamilien wirken auf Bestandteile pflanzlicher Zellwände und können daher zur Herstellung von Biokraftstoffen, Biochemikalien und Biomaterialien verwendet werden. Eines davon hat auch potenzielle Anwendungen in der Milchindustrie, weil es den Laktoseabbau fördert.

„Eine unserer Forschungslinien untersucht die Vielfalt Brasiliens auf der Suche nach neuartigen mikrobiellen Mechanismen, die die Widerspenstigkeit von lignozellulosehaltigen Abfällen verringern. Wir stellten fest, dass das Capybara ein hochgradig angepasster Pflanzenfresser ist, der in der Lage ist, Energie aus widerspenstigen Pflanzenabfällen zu gewinnen, und dass es nicht sehr untersucht wurde viel“, sagte Mário Tyago Murakami, wissenschaftlicher Direktor des LNBR und letzter Autor des Artikels, der über die in veröffentlichte Studie berichtet Naturkommunikation.

Das Capybara (Hydrochoerus hydrochaeris) ist das größte lebende Nagetier der Welt und wandelt den in Pflanzen enthaltenen Zucker sehr effizient in Energie um, obwohl es in einigen Kreisen unbeliebt ist, weil es die Zecke beherbergen kann, die Brasilianisches Fleckfieber überträgt, eine seltene, aber hoch tödliche Infektionskrankheit verursacht durch das Bakterium Rickettsia rickettsii.

„Es gibt viele Studien mit Wiederkäuern, insbesondere Rindern, aber Informationen über monogastrische Pflanzenfresser sind relativ spärlich. Im Gegensatz zu Wiederkäuern verdauen Capybaras Gras und andere Pflanzenstoffe im Blinddarm, dem ersten Teil des Dickdarms. Angesichts ihres hocheffizienten Zuckers Konvertierung, und weil Capybaras in der Region Piracicaba [of São Paulo state] sich unter anderem von Zuckerrohr ernähren, gingen wir von der Hypothese aus, dass im Verdauungstrakt des Tieres vorhandene Mikroorganismen einzigartige molekulare Strategien haben könnten, um diese für die brasilianische Industrie sehr wichtige Biomasse zu depolymerisieren“, sagte Gabriela Felix Persinoti, Bioinformatik-Forscherin am LNBR und korrespondierender Autor des Artikels.

Neuartige Methodik

Der in der Studie verwendete interdisziplinäre Ansatz umfasste Multi-Omics (Genomik, Transkriptomik und Metabolomik zur Charakterisierung molekularer Aspekte der Darmmikrobiota des Wasserschweins) und Bioinformatik sowie die Teilchenbeschleuniger von CNPEM zur Analyse der entdeckten Enzyme auf atomarer Ebene. „Ich kann mich an keine Studien erinnern, die all diese Techniken kombiniert haben, einschließlich der Verwendung von Synchrotronlicht [a source of extremely bright electromagnetic radiation that helps scientists observe the inner structures of materials]“, sagte Murakami. „In dieser Forschung ging unsere Analyse von der mikrobiellen Gemeinschaft bis zur atomaren Struktur bestimmter Proteine ​​hinunter.“

Die Wissenschaftler analysierten Proben aus dem Blinddarm und Rektum von drei weiblichen Wasserschweinen, die 2017 in Tatuí (Bundesstaat São Paulo) im Rahmen der lokalen Politik zur Kontrolle der Wasserschweinpopulation eingeschläfert wurden. Die Tiere waren weder trächtig noch mit R. rickettsii infiziert.

„Die Blinddarm- und Rektalproben wurden durch eine Bauchoperation entnommen. Das Material wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren. DNA- und RNA-Proben wurden im Labor extrahiert und einer groß angelegten Sequenzierung unter Verwendung integrativer Omics unterzogen“, sagte Persinoti.

Sie begannen mit der Sequenzierung von Markergenen, in diesem Fall 16S, die in allen Bakterien und Archaeen vorhanden sind. „Mit dieser ersten Sequenzierung konnten wir Unterschiede zwischen den Blinddarm- und Rektalproben feststellen und die wichtigsten Mikroorganismen darin identifizieren. Das Gen 16S gab uns eine oberflächliche Antwort darauf, welche Mikroorganismen vorhanden und mehr oder weniger häufig vorhanden waren, hat uns aber nicht gesagt, welche Enzyme die Mikroorganismen produzierten oder welche Enzyme in ihrem Genom vorhanden waren“, erklärte sie.

„Zu diesem Zweck haben wir eine andere Omics-Technik verwendet, die Metagenomik. Wir haben DNA aus der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft im Magen-Darm-Trakt der Wasserschweine einer groß angelegten Sequenzierung unterzogen und dabei eine größere Datenmenge erhalten. Durch den Einsatz einer Reihe von Bioinformatik-Tools waren wir es Wir konnten nicht nur die in jeder der Proben vorhandenen Genome und die Gene in jedem der Genome identifizieren, sondern auch herausfinden, welche Gene neu waren und welche Mikroorganismen noch nie beschrieben worden waren Funktionen der Gene, die das Potenzial hatten, bei der Depolymerisation von Biomasse und der Umwandlung von Zucker in Energie zu helfen.“

Außerdem wollten die Forscher wissen, welche Mikroorganismen zum Zeitpunkt der Probenentnahme am aktivsten waren – also welche Gene die Mikroorganismen tatsächlich exprimierten. Dazu nutzten sie Metatranscriptomics, deren Ausgangsmaterial RNA ist. „Eine weitere Technik, die wir verwendeten, war die Metabolomik, um zu bestätigen, welche Metaboliten die Mikroorganismen produzierten“, sagte Persinoti. „Durch die Kombination all dieser Informationen aus Omik, Bioinformatik und tatsächlicher und potenzieller Genexpression konnten wir die Rolle von Darmmikroorganismen bei der Erzielung einer solch hocheffizienten Umwandlung von Pflanzenfasern entschlüsseln und herausfinden, welche Gene an diesem Prozess beteiligt waren.“

Anschließend analysierten sie all diese Daten, um Gene zu identifizieren, die eine Schlüsselrolle bei der Verringerung der Widerspenstigkeit von Pflanzenfasern spielen könnten, wobei sie sich hauptsächlich auf bisher unbekannte Ziele konzentrierten. „Die Selektionsstrategie konzentrierte sich auf neuartige Genome mit einer Fülle von Genen, die an der Depolymerisation pflanzlicher Biomasse beteiligt sind“, sagte Persinoti. „Wir haben gesehen, wie diese Gene in den Genomen der Mikroorganismen organisiert sind, und haben diese Informationen genutzt, um herauszufinden, ob es in der Nähe Gene mit unbekannten Funktionen gibt, die möglicherweise am Abbau widerspenstiger Pflanzenfasern beteiligt sind. Das ist wichtig, weil es die Suche nach leitet neue Gene, aber erst wenn wir in der Lage waren, diese Ergebnisse zu einem späteren Zeitpunkt experimentell zu demonstrieren, konnten wir die Schaffung dieser neuartigen Enzymfamilien nachweisen.“

Nachdem sie diese Kandidaten identifiziert hatten, gingen sie zu einer biochemischen Demonstration ihrer Funktionen über. „Wir haben die Gene in vitro synthetisiert und sie mithilfe eines Bakteriums exprimiert, um die entsprechenden Proteine ​​herzustellen“, sagte Persinoti. „Wir haben mehrere enzymatische und biochemische Assays durchgeführt, um die Funktionen dieser Proteine ​​​​und wo sie wirken, zu entdecken. Wir haben die Atomstrukturen der Proteine ​​​​mit Synchrotronlicht und anderen Techniken bestimmt. Mit diesen funktionellen und strukturellen Informationen konnten wir andere Experimente durchführen, um sie zu finden herauszufinden, welche Regionen der Proteine ​​für ihre Aktivität entscheidend sind, und die molekularen Mechanismen zu analysieren, die ihrer Funktion zugrunde liegen.“

Laut Murakami stellte die doppelte Validierung sicher, dass tatsächlich neuartige Familien beteiligt waren. „Wir haben ein Gen ausgewählt, das dem, das wir zuvor untersucht hatten, nicht sehr ähnlich war, aus der Reihe von Sequenzen, die theoretisch das Universum einer neu entdeckten Familie bildeten. Wir haben das Gen synthetisiert, gereinigt, biochemisch charakterisiert und gezeigt, dass die Sequenz dasselbe hatte funktionellen Eigenschaften wie die vorherige“, erklärte er. „Mit anderen Worten, wir haben ein zweites Mitglied der neuen Familie charakterisiert, um absolut sicher zu sein, dass diese Proteine ​​tatsächlich eine neue Familie darstellen.“

Neuartige Enzyme und Cocktails

Persinoti enthüllte, dass eine der neu entdeckten Familien namens GH173 potenzielle Anwendungen in der Lebensmittelindustrie hat, während eine andere namens CBM89 mit der Kohlenhydraterkennung in Verbindung gebracht wird und die Produktion von Ethanol der zweiten Generation aus Zuckerrohrbagasse und Stroh erleichtern könnte.

Die Forscher entwickeln auch Enzymcocktails mit Enzym-hyperproduzierenden Pilzen, und die neu entdeckten Enzyme könnten natürlich in diese Pilzplattformen aufgenommen werden. „Die Entdeckung neuartiger Enzymfamilien kann in den Technologietransfer integriert werden, um Innovationen zu unterstützen“, sagte Murakami. „In unserer Gruppe sind wir sehr daran interessiert, diesen großen brasilianischen Biodiversitätsschatz zu erforschen, insbesondere um zu verstehen, was wir dunkle genomische Materie nennen – Teile dieser komplexen mikrobiellen Gemeinschaften mit unbekanntem Potenzial. Unser Zentrum verfügt zu diesem Zweck über eine hervorragende Infrastruktur und zusammen mit Unsere Partnerschaften mit öffentlichen Universitäten haben es ermöglicht, dass wettbewerbsfähige Forschung dieser Art in Brasilien durchgeführt werden kann.Tatsächlich wurden 99 % der Arbeit, vom Konzeptentwurf bis zur Ausführung, Analyse und Niederschrift, hier geleistet.Angesichts des immensen Reichtums der brasilianischen Biodiversität , war es nur zu erwarten, dass wir die Bedingungen und Fähigkeiten haben würden, um solche hochwirksamen Entdeckungen zu machen.“