Enzymatische Synthesemethode erweitert Möglichkeiten und eliminiert gleichzeitig toxische Nebenprodukte

Während die COVID-19-Impfstoffe viele Menschen mit RNA-basierten Medikamenten bekannt gemacht haben, sind RNA-Oligonukleotide bereits seit Jahren auf dem Markt, um Krankheiten wie die Muskeldystrophie Duchenne und Amyloidose zu behandeln. RNA-Therapien bieten viele Vorteile gegenüber herkömmlichen niedermolekularen Medikamenten, darunter ihre Fähigkeit, fast jede genetische Komponente innerhalb von Zellen anzusprechen und Gen-Editierungswerkzeuge wie CRISPR zu ihren Zielen zu führen.

Allerdings ist das Potenzial von RNA derzeit begrenzt, da die schnell wachsende weltweite Nachfrage die Produktionskapazitäten der Industrie übersteigt. Die Standardmethode zur chemischen Synthese von RNA wurde in den 1980er Jahren erfunden und erfordert spezielle Geräte und arbeitsintensive Prozesse.

Chemische Synthesemethoden sind zudem hinsichtlich der Auswahl an Nukleotidbausteinen, die sie in RNA-Moleküle einbauen können, begrenzt und produzieren Tonnen giftiger chemischer Nebenprodukte, die Umweltschäden verursachen und die Produktionskapazität der Fabriken einschränken. Diese Probleme werden sich nur noch verschärfen, wenn die RNA-Produktion als Reaktion auf die Nachfrage gesteigert wird.

Ein Wissenschaftlerteam des Wyss Institute der Harvard University und der Harvard Medical School (HMS) hat eine Lösung für dieses Problem gefunden: ein neues RNA-Syntheseverfahren, das den Spielraum für die Entwicklung therapeutischer RNA-Verfahren erweitert und das Potenzial für eine schnelle Skalierung freisetzt, die mit der chemischen Synthese nicht erreicht werden kann.

Mit ihrer neuen Methode kann RNA mit einer Effizienz und Reinheit produziert werden, die mit den aktuellen Industriestandards vergleichbar ist. Dabei werden Wasser und Enzyme verwendet, statt der giftigen Lösungsmittel und explosiven Katalysatoren, die die aktuelle Produktion beeinträchtigen. Sie kann außerdem alle gängigen molekularen Modifikationen umfassen, die heute in RNA-Medikamenten zu finden sind, und hat das Potenzial, neuartige RNA-Chemikalien für neue Therapieformen zu integrieren.

Die Leistung wird in einem heute veröffentlichten Artikel beschrieben in Natur Biotechnologie.

„Da die Nachfrage nach RNA-Medikamenten weiter steigt und zusätzliche Produkte auf den Markt kommen, werden wir das derzeitige weltweite Angebot an Acetonitril, dem organischen Lösungsmittel, das bei chemischen RNA-Synthesemethoden verwendet wird, übertreffen“, sagte Co-Erstautor Jonathan Rittichier, Ph.D., ein ehemaliger Postdoktorand bei Wyss und HMS. Er und sein Mitautor und ehemaliger Wyss-Forschungswissenschaftler Daniel Wiegand, MSCh.E.; Wyss Core Faculty-Mitglied George Church, Ph.D., und andere gründeten EnPlusOne Biosciences, um ihre Technologie zu kommerzialisieren.

„Um der Welt RNA-Medikamente in diesem Umfang zur Verfügung zu stellen, ist ein Paradigmenwechsel hin zu einer erneuerbaren, wässrigen Synthese erforderlich, und wir glauben, dass unsere firmeneigene Enzymtechnologie diesen Wechsel ermöglichen wird“, fügte Rittichier hinzu.

Ein besserer, umweltfreundlicher Weg

In Churchs Labor erkannten Rittichier, Wiegand und der Co-Autor Erkin Kuru, Ph.D., dass die Pharmaindustrie mitten in einer RNA-Revolution steckte. Das Labor hatte zuvor eine Methode entwickelt, DNA mithilfe von Enzymen zu synthetisieren, und vermutete, dass sie dasselbe mit RNA tun könnten.

Die Wissenschaftler begannen mit einem Enzym aus einem Hefestamm, Schizosaccharomyces pombe, der dafür bekannt ist, Nukleotidmoleküle zu RNA-Strängen zu verknüpfen. Sie veränderten das Enzym, um es effizienter zu machen und es in die Lage zu versetzen, nicht standardmäßige Nukleotide in RNA einzubauen. Dies war besonders wichtig für den Aufbau einer nützlichen Plattform für die Arzneimittelentwicklung, da jedes von der FDA zugelassene RNA-Medikament Nukleotide enthält, die gegenüber ihrer ursprünglichen Form modifiziert wurden, um ihre Stabilität im Körper zu erhöhen oder ihnen neue Funktionen zu verleihen.

Anschließend konzentrierten sie sich auf die Nukleotide selbst. Bei der standardmäßigen chemischen RNA-Synthese werden den Nukleotiden „Schutzgruppen“ hinzugefügt: eine Art chemische Luftpolsterfolie, die verhindert, dass das Molekül durch die harten Reaktionsbedingungen beschädigt wird.

Damit die RNA funktioniert, müssen diese Schutzgruppen nach der Synthese entfernt werden. Dieser Prozess erfordert eine zusätzliche Runde chemischer Reaktionen, die die RNA während ihrer Entstehung beschädigen können. Die milderen Bedingungen der Synthese von EnPlusOne machen sperrige Luftpolsterfolie überflüssig, was letztlich zu einer besseren Herstellung führt.

Doch obwohl das Enzym des Teams ein Problem löste, brachte es ein anderes mit sich: Seine natürliche Aktivität würde Nukleotide unkontrolliert aneinanderreihen, was zu ungenauen RNA-Sequenzen führte. Um dieses Problem zu lösen, modifizierten sie ihre Nukleotide mit einem „Blocker“, einer chemischen Gruppe, die das Enzym blockiert und nur die Zugabe eines Nukleotids auf einmal zulässt. Sobald das gewünschte Nukleotid hinzugefügt wurde, wird der Blocker entfernt, damit das nächste Nukleotid in der Sequenz binden kann. Dies führt zu einem zweistufigen Prozess, der einfacher und weniger reagenzienintensiv ist als die typische vierstufige chemische Synthesemethode.

Die Forscher zeigten, dass ihr neues Verfahren Nukleotide mit einer Effizienz von 95 % einbaute, was mit der chemischen Synthese vergleichbar ist. Anschließend wiederholte das Team iterativ Zyklen der enzymatischen RNA-Synthese, um Moleküle mit einer Länge von 10 Nukleotiden aufzubauen. Sie sind nun routinemäßig in der Lage, Moleküle mit einer Länge von 23 Nukleotiden aufzubauen, was der Größe vieler Blockbuster-RNA-Therapeutika entspricht.

Von Molekülen zu Medikamenten

Der Schlüssel zur Umwandlung von RNA in nützliche Medikamente liegt in der Modifizierung ihrer natürlich vorkommenden Nukleotide. Das Team zeigte auch, dass seine enzymatische Synthesemethode erfolgreich RNA-Stränge mit mehreren Arten modifizierter Nukleotide produzieren konnte, die dieselbe Fähigkeit wie natürliche Nukleotide besaßen.

„Natürliche RNA besteht aus vier Buchstaben – A, U, C und G – aber wir können dieses einfache Alphabet mit synthetischer Biologie erweitern“, sagte Kuru, der Postdoktorand am HMS ist. „Unser Verfahren erhöht im Wesentlichen die Anzahl der Tasten auf unserer ‚RNA-Schreibmaschine‘ zu einem viel umfangreicheren Alphabet, mit dem wir RNAs mit neuen Funktionen und Eigenschaften schreiben können.“

Diese Arbeit bildete die Grundlage für ein Validierungsprojekt am Wyss Institute in den Jahren 2019 und 2020, bei dem das Risiko reduziert und die Studie für die Kommerzialisierung vorbereitet wurde.

„Enzymatische Nukleotidsynthesetechnologien bieten als Alternative zu chemischen Methoden viele Vorteile. Diese Plattform kann dazu beitragen, das immense Potenzial von RNA-Therapeutika auf nachhaltige Weise freizusetzen, insbesondere bei der Herstellung hochwertiger Leit-RNA-Moleküle für die CRISPR/Cas-Genbearbeitung“, sagte Co-Autor Church, der auch Robert Winthrop-Professor für Genetik an der HMS ist.

EnPlusOne nutzt seine Plattform außerdem zur Herstellung kleiner interferierender RNAs (siRNAs) im Labormaßstab, die zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt werden könnten.

„RNA-Medikamente bieten einen wirkungsvollen neuen Behandlungsansatz für eine große Bandbreite von Krankheiten. Die derzeitigen Herstellungsverfahren für diese Medikamente sind jedoch hinsichtlich der chemischen Vielfalt, die sie erzeugen können, der Menge an Material, die zu vertretbaren Kosten produziert werden kann, und ihrer negativen Auswirkungen auf die Umwelt aufgrund der dafür benötigten aggressiven Chemikalien begrenzt. Die elegante bioinspirierte Enzymsynthese-Alternative von EnPlusOne bietet eine Möglichkeit, all diese Einschränkungen zu überwinden und könnte der RNA-Therapeutika-Industrie zu einem regelrechten Boom verhelfen“, sagte Wyss-Gründungsdirektor Don Ingber, MD, Ph.D.

Weitere Autoren der Natur Biotechnologie Zu den Autoren des Papiers gehören Ella Meyer, Howon Lee, Nicholas J. Conway, Daniel Ahlstedt, Zeynep Yurtsever und Dominic Rainone. Lee und Ahlstedt sind auch Mitbegründer von EnPlusOne.