Entschlüsselung eines Schlüsselteils der Zelle, Atom für Atom

Was auch immer Sie tun, ob Sie Auto fahren, joggen oder sogar in Ihrer Faulheit Chips essen und auf der Couch fernsehen, in jeder Ihrer Zellen arbeitet eine ganze Reihe molekularer Maschinen hart. Diese Maschinerie, die viel zu klein ist, um sie mit bloßem Auge oder sogar mit vielen Mikroskopen zu sehen, erzeugt Energie für die Zelle, stellt ihre Proteine ​​her, erstellt Kopien ihrer DNA und vieles mehr.

Unter diesen Maschinenteilen und einer der komplexesten ist etwas, das als Kernporenkomplex (NPC) bekannt ist. Der NPC, der aus mehr als 1.000 einzelnen Proteinen besteht, ist ein unglaublich diskriminierender Torwächter für den Zellkern, die membrangebundene Region innerhalb einer Zelle, die das genetische Material dieser Zelle enthält. Alles, was in den Nukleus hinein- oder hinausgeht, muss auf seinem Weg den NPC passieren.

Die Rolle des NPC als Torwächter des Kerns bedeutet, dass er für den Betrieb der Zelle von entscheidender Bedeutung ist. Innerhalb des Zellkerns wird DNA, der permanente genetische Code der Zelle, in RNA kopiert. Diese RNA wird dann aus dem Zellkern herausgetragen, damit sie zur Herstellung der Proteine ​​verwendet werden kann, die die Zelle benötigt. Der NPC stellt sicher, dass der Kern die Materialien erhält, die er für die Synthese von RNA benötigt, während er gleichzeitig die DNA vor der rauen Umgebung außerhalb des Kerns schützt und es der RNA ermöglicht, den Kern zu verlassen, nachdem sie hergestellt wurde.

„Es ist ein bisschen wie in einem Flugzeughangar, in dem man 747 reparieren kann, und die Tür öffnet sich, um die 747 hereinzulassen, aber dort steht eine Person, die verhindern kann, dass eine einzige Murmel herauskommt, während die Türen offen sind“, sagt André von Caltech Hoelz, Professor für Chemie und Biochemie und Fakultätsstipendiat des Howard Hughes Medical Institute. Seit mehr als zwei Jahrzehnten untersucht und entschlüsselt Hoelz die Struktur des NPC in Bezug auf seine Funktion. Im Laufe der Jahre hat er seine Geheimnisse immer weiter herausgearbeitet und sie Stück für Stück für Stück enträtselt.

Die Auswirkungen dieser Forschung sind potenziell enorm. Der NPC ist nicht nur zentral für die Operationen der Zelle, er ist auch an vielen Krankheiten beteiligt. Mutationen im NPC sind für einige unheilbare Krebsarten, für neurodegenerative und Autoimmunerkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und akute nekrotisierende Enzephalopathie sowie für Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern und frühen plötzlichen Herztod verantwortlich. Darüber hinaus zielen viele Viren, einschließlich des für COVID-19 verantwortlichen, auf den NPC und schalten ihn im Laufe seines Lebenszyklus ab.

Jetzt in zwei in der Zeitschrift veröffentlichten Artikeln Wissenschaftbeschreiben Hoelz und sein Forschungsteam zwei wichtige Durchbrüche: die Bestimmung der Struktur der Außenseite des NPC und die Aufklärung des Mechanismus, durch den spezielle Proteine ​​wie ein molekularer Klebstoff wirken, um den NPC zusammenzuhalten.

Ein sehr kleines 3D-Puzzle

In ihrer Arbeit mit dem Titel „Architektur des zytoplasmatischen Gesichts der Kernpore“ beschreiben Hoelz und sein Forschungsteam, wie sie die Struktur der Seite des NPC, die vom Zellkern nach außen zeigt, in das Zytoplasma der Zellen kartiert haben. Dazu mussten sie das Äquivalent eines sehr kleinen 3D-Puzzles lösen, wobei sie bildgebende Verfahren wie Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie für jedes Puzzleteil verwendeten.

Stefan Petrovic, ein Doktorand in Biochemie und molekularer Biophysik und einer der Co-Erstautoren der Veröffentlichungen, sagt, dass der Prozess mit Escherichia coli-Bakterien (einem Bakterienstamm, der üblicherweise in Labors verwendet wird) begann, die gentechnisch verändert wurden, um die Proteine ​​zu produzieren, die das bilden den menschlichen NPC.

„Wenn Sie das Labor betreten, können Sie diese riesige Wand aus Kolben sehen, in denen Kulturen wachsen“, sagt Petrovic. „Wir exprimieren jedes einzelne Protein in E. coli-Zellen, brechen diese Zellen auf und reinigen jede Proteinkomponente chemisch.“

Sobald diese Reinigung – die bis zu 1.500 Liter Bakterienkultur erfordern kann, um genügend Material für ein einziges Experiment zu erhalten – abgeschlossen war, begann das Forschungsteam, akribisch zu testen, wie die Teile des NPC zusammenpassen.

George Mobbs, ein hochrangiger Postdoktorand und wissenschaftlicher Mitarbeiter in Chemie und ein weiterer Co-Erstautor der Arbeit, sagt, dass die Versammlung „schrittweise“ erfolgte; Anstatt alle Proteine ​​gleichzeitig in ein Reagenzglas zu gießen, testeten die Forscher Proteinpaare, um zu sehen, welche wie zwei Puzzleteile zusammenpassen würden. Wenn ein Paar gefunden wurde, das zusammenpasste, testeten die Forscher die beiden jetzt kombinierten Proteine ​​gegen ein drittes Protein, bis sie eines fanden, das zu diesem Paar passte, und dann wurde die resultierende dreiteilige Struktur gegen andere Proteine ​​​​getestet und so weiter an. Auf diese Weise durch die Proteine ​​zu arbeiten, brachte schließlich das Endergebnis ihrer Arbeit hervor: einen Keil aus 16 Proteinen, der acht Mal wiederholt wird, wie Pizzastücke, um das Gesicht des NPCs zu formen.

„Wir haben die erste vollständige Struktur des gesamten zytoplasmatischen Gesichts des menschlichen NPC zusammen mit einer strengen Validierung gemeldet, anstatt eine Reihe von inkrementellen Fortschritten von Fragmenten oder Teilen zu melden, die auf einer teilweisen, unvollständigen oder niedrig aufgelösten Beobachtung basieren“, sagt Si Nie , Postdoctoral Scholar Research Associate in Chemie und auch Co-Erstautor der Arbeit. „Wir haben uns entschieden, geduldig zu warten, bis wir alle notwendigen Daten gesammelt haben, und haben eine riesige Menge neuer Informationen gemeldet.“

Ihre Arbeit ergänzte die Forschung von Martin Beck vom Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt, Deutschland, dessen Team Kryo-Elektronentomographie verwendete, um eine Karte zu erstellen, die die Konturen eines Puzzles lieferte, in das die Forscher die Teile legen mussten. Um die Vollendung des Puzzles der menschlichen NPC-Struktur zu beschleunigen, tauschten Hoelz und Beck vor mehr als zwei Jahren Daten aus und bauten dann unabhängig voneinander Strukturen des gesamten NPC. „Die wesentlich verbesserte Beck-Karte zeigte viel deutlicher, wo jedes Teil des NPCs – für das wir die atomaren Strukturen bestimmt haben – platziert werden musste, ähnlich einem Holzrahmen, der den Rand eines Puzzles definiert“, sagt Hoelz.

Die experimentell ermittelten Strukturen der NPC-Stücke der Gruppe Hoelz dienten der Validierung der Modellierung der Gruppe Beck. „Wir haben die Strukturen unabhängig voneinander und mit unterschiedlichen Ansätzen in die Karte eingefügt, aber die Endergebnisse stimmten völlig überein. Es war sehr befriedigend, das zu sehen“, sagt Petrovic.

„Wir haben einen Rahmen aufgebaut, auf dem jetzt viele Experimente durchgeführt werden können“, sagt Christopher Bley, ein leitender Postdoktorand in Chemie und ebenfalls Co-Erstautor. „Wir haben jetzt diese zusammengesetzte Struktur, und sie ermöglicht und informiert zukünftige Experimente zur NPC-Funktion oder sogar zu Krankheiten. Es gibt viele Mutationen im NPC, die mit schrecklichen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, und wir wissen, wo sie sich in der Struktur befinden und wie sie es tun come together kann dabei helfen, die nächste Reihe von Experimenten zu entwerfen, um zu versuchen, die Fragen zu beantworten, was diese Mutationen bewirken.“

‚Dieses elegante Arrangement aus Spaghetti-Nudeln‘

In der anderen Veröffentlichung mit dem Titel „Architektur des Linker-Gerüsts in der Kernpore“ beschreibt das Forschungsteam, wie es die gesamte Struktur dessen bestimmt hat, was als Linker-Gerüst des NPC bekannt ist – die Ansammlung von Proteinen, die helfen, den NPC zusammenzuhalten Gleichzeitig bietet es ihm die Flexibilität, die es braucht, um sich zu öffnen und zu schließen und sich an die passierenden Moleküle anzupassen.

Hoelz vergleicht den NPC mit etwas, das aus Legosteinen gebaut ist, die zusammenpassen, ohne sich zu verriegeln, und stattdessen von Gummibändern zusammengehalten werden, die sie größtenteils an Ort und Stelle halten und ihnen dennoch erlauben, sich ein wenig zu bewegen.

„Ich nenne diese unstrukturierten Kleberstücke die ‚dunkle Materie der Pore‘“, sagt Hoelz. „Dieses elegante Arrangement aus Spaghetti-Nudeln hält alles zusammen.“

Das Verfahren zur Charakterisierung der Struktur des Linker-Gerüsts war im Wesentlichen das gleiche wie das Verfahren, das zur Charakterisierung der anderen Teile des NPC verwendet wurde. Das Team stellte große Mengen der vielen Arten von Linker- und Gerüstproteinen her und reinigte sie, verwendete eine Vielzahl von biochemischen Experimenten und bildgebenden Verfahren, um einzelne Wechselwirkungen zu untersuchen, und testete sie Stück für Stück, um zu sehen, wie sie im intakten NPC zusammenpassen.

Um ihre Arbeit zu überprüfen, fügten sie Mutationen in die Gene ein, die für jedes dieser Linker-Proteine ​​in einer lebenden Zelle kodieren. Da sie wussten, wie diese Mutationen die chemischen Eigenschaften und die Form eines bestimmten Linker-Proteins verändern und es defekt machen würden, konnten sie vorhersagen, was mit der Struktur der NPCs der Zelle passieren würde, wenn diese defekten Proteine ​​eingeführt würden. Wenn die NPCs der Zelle wie erwartet funktionell und strukturell defekt waren, wussten sie, dass sie die richtige Anordnung der Linker-Proteine ​​hatten.

„Eine Zelle ist viel komplizierter als das einfache System, das wir in einem Reagenzglas erstellen, daher ist es notwendig zu überprüfen, ob die Ergebnisse aus In-vitro-Experimenten in vivo Bestand haben“, sagt Petrovic.

Der Zusammenbau der Außenseite des NPC trug auch dazu bei, ein langjähriges Rätsel um die Kernhülle, das Doppelmembransystem, das den Kern umgibt, zu lösen. Wie die Membran der Zelle, in der sich der Kern befindet, ist die Kernmembran nicht vollkommen glatt. Vielmehr ist es mit Molekülen besetzt, die integrale Membranproteine ​​​​(IMPs) genannt werden, die in einer Vielzahl von Rollen dienen, einschließlich der Funktion als Rezeptoren und der Unterstützung bei der Katalyse biochemischer Reaktionen.

Obwohl IMPs sowohl auf der Innen- als auch auf der Außenseite der Kernhülle zu finden sind, war bisher unklar, wie sie tatsächlich von einer Seite zur anderen gewandert sind. Da IMPs in der Membran stecken, können sie tatsächlich nicht einfach durch den zentralen Transportkanal des NPCs gleiten, wie es frei schwebende Moleküle tun.

Nachdem das Team von Hoelz die Struktur des Linker-Gerüsts des NPCs verstanden hatte, erkannte es, dass es die Bildung kleiner „Rinnsteine“ um seine Außenkante ermöglicht, die es den IMPs ermöglichen, von einer Seite der Kernhülle am NPC vorbei zur anderen zu schlüpfen immer in der Membran selbst eingebettet bleiben.

„Es erklärt viele Dinge, die auf diesem Gebiet rätselhaft waren. Ich freue mich sehr zu sehen, dass der zentrale Transportkanal tatsächlich die Fähigkeit hat, sich zu erweitern und seitliche Tore für diese IMPs zu bilden, wie wir es ursprünglich vor mehr als einem Jahrzehnt vorgeschlagen hatten “, sagt Hölz.

Zusammengenommen stellen die Ergebnisse der beiden Papiere einen Sprung nach vorne im Verständnis der Wissenschaftler dar, wie der menschliche NPC aufgebaut ist und wie er funktioniert. Die Entdeckungen des Teams öffnen die Tür für viel mehr Forschung. „Nachdem wir seine Struktur bestimmt haben, können wir uns nun darauf konzentrieren, die molekularen Grundlagen für die Funktionen des NPC herauszuarbeiten, wie zum Beispiel, wie mRNA exportiert wird, und die zugrunde liegenden Ursachen für die vielen NPC-assoziierten Krankheiten mit dem Ziel, neuartige Therapien zu entwickeln“, sagt Hoelz.

Die Artikel, die die Arbeit beschreiben, erscheinen in der Ausgabe der Zeitschrift vom 10. Juni Wissenschaft.