Einige CRISPR-Screens könnten Ziele für Krebsmedikamente übersehen

Die Genbearbeitung mit CRISPR/Cas9 hat eine Vielzahl biomedizinischer Experimente ermöglicht, darunter Studien, bei denen systematisch Gene in Krebszellen abgeschaltet werden, um nach Genen zu suchen, von denen die Krebszellen stark abhängig sind, um zu überleben und zu wachsen. Diese Gene oder „Krebsabhängigkeiten“ sind oft vielversprechende Wirkstoffziele. Neue Forschungsergebnisse zeigen jedoch, dass viele dieser CRISPR-Screening-Experimente auf Komponenten, sogenannten CRISPR/Cas9-Leitfäden, angewiesen sind, die in Zellen von Menschen aller Abstammung nicht gleich gut funktionieren, was dazu führen kann, dass CRISPR-Screenings Krebsabhängigkeiten übersehen.

Diese CRISPR-Anleitungen sind kurze RNA-Sequenzen, die das CRISPR-Cas9-Enzym zu einer bestimmten Stelle im Genom lenken, um DNA zu schneiden und ein Zielgen zu deaktivieren. Die neuen Erkenntnisse von Wissenschaftlern des Broad Institute of MIT und Harvard zeigen, dass etwa 2 Prozent dieser Anleitungen ihr Ziel verfehlen. Das bedeutet, dass Cas9 keinen Schnitt macht und ein bestimmtes Gen deaktiviert, wodurch eine mögliche Rolle dieses Gens beim Krebswachstum verschleiert wird. Das Team fand heraus, dass dies in Zellen von Menschen afrikanischer Abstammung überproportional häufig vorkommt, weil CRISPR-Anleitungen unter Verwendung von Referenzgenomen von Menschen entwickelt wurden, die größtenteils europäischer Abstammung sind und die globale genetische Vielfalt nicht vollständig repräsentieren.

„Diese Ungenauigkeiten existieren an Stellen, die wir möglicherweise nicht erkennen, und auf eine Art und Weise, die wir nicht vorhergesehen hätten“, sagte Rameen Beroukhim, assoziiertes Mitglied des Broad und Co-Seniorautorin des kürzlich erschienenen Artikels in Naturkommunikation„Diese Arbeit zeigt, dass es sich wirklich lohnt, eine systematische Bewertung aller von uns verwendeten Tools und Datensätze durchzuführen, damit wir diese versteckten Verzerrungen beheben können, bevor sie zu einem Problem werden.“

„CRISPR wird in der präklinischen Forschung allgegenwärtig eingesetzt, aber nur eine Minderheit der Forscher denkt sorgfältig über die spezifische Keimbahn und Abstammung nach, die sich auf ihre Modellsysteme bezieht“, fügte Jesse Boehm hinzu, assoziierter Wissenschaftler am Broad und Co-Seniorautor des Artikels. „Dies ist ein Warnsignal an die Gemeinschaft, dass die funktionelle Genomik nicht immun gegen Abstammungsverzerrungen ist, und eine Gelegenheit, diese Art von Daten genauer zu untersuchen.“

Für ihre Studie analysierte das Team Daten der Broad’s Cancer Dependency Map (DepMap), der umfangreichsten Ressource zum Thema Krebsabhängigkeit, die gegenwärtig genomweite Screens von mehr als 1.000 Krebszelllinien umfasst, von denen etwa 90 Prozent von Menschen europäischer oder ostasiatischer Abstammung stammen.

Francisca Vazquez, Direktorin der DepMap am Broad, sagte, dass weniger als 1 Prozent der Zelllinien-Leitlinienpaare in der DepMap von dem in dieser Studie aufgezeigten Abstammungsbias betroffen seien, dass es aber wichtig sei, diese Verzerrungen zu erkennen und in zukünftigen Bibliotheken zu beheben. Nachdem diese Ergebnisse 2022 erstmals als Vorabdruck veröffentlicht wurden, entfernte das DepMap-Team alle Leit-RNAs, die nicht funktionierten, aus seiner Bibliothek, sodass die Datenbank nicht fälschlicherweise keine Abhängigkeiten für die betroffenen Gene zurückgibt, sondern anzeigt, dass nicht genügend Daten vorhanden sind, um Schlussfolgerungen zu ziehen.

Eine neue Art der Abhängigkeitssuche

Bisher konzentrierte sich die Suche nach Krebsabhängigkeiten auf genetische Veränderungen, die im Laufe des Lebens eines Menschen in einigen Zellen auftreten, sogenannte somatische Mutationen. Als der Postdoktorand und Erstautor der Studie, Sean Misek, 2020 in die Labore von Boehm und Beroukhim eintrat, wollte er wissen, wie Keimbahn-Genvarianten – die vererbt werden und in allen Zellen des Körpers vorkommen – die Reaktion von Tumoren auf die Behandlung beeinflussen.

Misek fand viele starke Assoziationen zwischen Abstammung und genetischer Abhängigkeit und dass die meisten dieser Assoziationen von Artefakten herrührten, die mit Keimbahnvarianten in Zusammenhang standen. Insbesondere sah er diese Effekte in CRISPR-Anleitungen. Die Sequenz der Anleitungs-RNAs stimmte nicht ausreichend mit der genetischen Zielsequenz überein, da diese Zielsequenz je nach Abstammung variierte.

Die Wissenschaftler fanden heraus, dass 89 Prozent der Leitsequenzen in Genombibliotheken in mindestens einer Zelllinie eine Fehlpaarung aufweisen. Sie stellten außerdem fest, dass Fehlpaarungen in Zellen von Menschen afrikanischer Abstammung häufiger vorkommen.

„Diese Art experimenteller Verzerrungen gibt es in der präklinischen Forschung wahrscheinlich überall“, sagte Misek. „Wir hoffen, dass dieser Artikel Teil einer größeren Diskussion ist.“

Das Ausmaß dieser Verzerrung in einem Forschungsprojekt zu verstehen, kann für einen Wissenschaftler eine Herausforderung sein, da es mehrere Tage dauern kann, alle dafür erforderlichen Daten herunterzuladen. Um dieses Problem zu lösen, haben Boehm, Beroukhim und das Pattern-Team am Broad Ancestry Garden erstellt, eine Website, die auf Daten der Genome Aggregation Database (gnomAD) basiert und Forschern dabei helfen kann, die Auswirkungen der Abstammung auf einen Leitfaden ihrer Wahl zu bestimmen.

„Viele Labore verwenden CRISPR in gewisser Weise und sie sollten über einen Mechanismus verfügen, um ihre Reagenzien zu überprüfen“, sagte Misek. „Unser Ziel ist es, es den Leuten ein wenig leichter zu machen, dieses Problem selbst zu lösen.“

Bibliotheksunterricht

Boehm sagte, dass genetische Variationen aufgrund der Abstammung die Forschung weit über die Suche nach Krebsabhängigkeiten hinaus beeinflussen und dass das Ausmaß, in dem die Ergebnisse des Teams einzelne Studien beeinflussen, unterschiedlich sein wird. Obwohl der Effekt dieser Verzerrung im DepMap relativ gering war, könnte er in Experimenten, die nur eine oder eine kleine Anzahl von Zelllinien untersuchen, viel größer sein, sagte Boehm.

Das Studienteam und die DepMap-Forscher sagen, dass dieser Verzerrung künftig vor allem durch die Erhöhung der genetischen Vielfalt in großen Zelllinienbibliotheken begegnet werden kann.

„Wir ermutigen die Gemeinschaft, uns Zelllinien von unterrepräsentierten Bevölkerungsgruppen zu schicken, wenn sie welche haben“, sagte Vazquez. „Das ist ein sehr wichtiges Thema, das wir angehen müssen.“