Eine schnelle und effiziente Methode zum Nachweis von microRNAs

In den frühen 1990er Jahren identifizierten Wissenschaftler, die die Entwicklung eines Spulwurms untersuchten, ein kleines RNA-Molekül, das die Expression bestimmter Gene regulierte. Dies markierte die Entdeckung von microRNAs (miRNAs), von denen heute bekannt ist, dass sie in allen Lebensformen vorhanden sind. Wie sich herausstellt, spielen diese Moleküle in vielen biologischen Prozessen eine wesentliche Rolle.

Einige Jahre später erkannten die Forscher, dass Krankheiten die Expression von miRNAs dysregulieren könnten, was ihr Potenzial als Biomarker hervorhob. Tatsächlich ist eine anormale miRNA-Expression ein Kennzeichen aller Tumorerkrankungen. Daher können miRNA-Nachweistechniken für die Früherkennung von Krebs nützlich sein.

Allerdings sind miRNAs klein und werden leicht abgebaut, was ihren schnellen Nachweis und ihre Quantifizierung erschwert. Um miRNAs in einer Probe nachzuweisen, müssen sie in der Regel zunächst „amplifiziert“ werden. Vereinfacht gesagt bedeutet dies, eine Ziel-miRNA mehrfach über biochemische Prozesse zu replizieren, damit diese mit kostengünstigen Methoden leichter nachweisbar ist. Leider können die meisten hochmodernen Techniken zur miRNA-Amplifikation mehr als fünf Stunden in Anspruch nehmen, was ihre Verwendung bei Point-of-Care-Tests einschränkt.

Vor diesem Hintergrund hat ein Forschungsteam, dem Associate Professor Chong Zhang von der Tsinghua University, China, angehört, kürzlich eine neue Methode zur schnellen miRNA-Amplifikation und -Detektion entwickelt. Wie in ihrem neuesten Artikel erklärt, der in veröffentlicht wurde BioDesign-Forschungkombinierte das Team zwei gut untersuchte biochemische Techniken in einer Weise, die die erforderliche Gesamtzeit erheblich reduzierte.

Die erste Technik, die sie verwendeten, heißt Rolling Circle Amplification (RCA). Bei RCA besteht die Idee darin, ein kreisförmiges DNA-Molekül oder eine „Sonde“ zu entwerfen, an die das Ziel-RNA-Fragment bindet. Sobald DNA-Polymerase-Enzyme und die notwendigen DNA-Bausteine ​​eingeführt sind, wird das RNA-Fragment verlängert, indem Nukleotide hinzugefügt werden, die komplementär zu der kreisförmigen Sonde sind. Dieser Prozess führt zu einem langen Einzelstrang genetischen Materials, das mehrere Kopien der kreisförmigen Sonde enthält.

Hier kommt die zweite Technik, CRISPR-Cas12a, ins Spiel. CRISPR-Cas12a ist ein weit verbreitetes genetisches Werkzeug, bei dem ein molekularer Komplex so konstruiert wird, dass er an eine spezifische DNA-Sequenz bindet. In diesem Fall gestalteten die Forscher den Komplex so, dass er an eine Region in der komplementären Sequenz zur kreisförmigen Sonde bindet.

Das heißt, die CRISPR-Cas12a-Komplexe banden mehrfach entlang des DNA-Einzelstrangs, der über RCA produziert wurde. Sobald diese Komplexe gebunden waren, wurde der Cas12a-Teil aktiviert und eine fluoreszierende Sonde von ihrem Quencher abgespalten. Dies wiederum erzeugte ein leicht nachweisbares Fluoreszenzsignal, das umso heller war, je mehr die anfängliche Ziel-RNA amplifiziert wurde.

Neben der Kombination dieser Techniken verbesserten die Forscher die Reaktionszeit des RCA-Schritts durch die Verwendung von „präzirkularisierten Sonden“. Das heißt, im Gegensatz zu den meisten Standard-RCA-Verfahren wurde den Sonden ihre kreisförmige Form vor der Reaktion gegeben.

Wie Prof. Zhang anmerkt, machte dies den Nachweisprozess viel schneller, ohne die Leistung des Systems zu beeinträchtigen: „Der Nachweis von miRNA konnte in nur 70 Minuten statt der üblichen fünf Stunden abgeschlossen werden, mit einer hervorragenden Nachweisgrenze von 8,1 pM und sehr hohe Spezifität.“

Insgesamt zeichnet der vorgeschlagene Ansatz eine glänzende Zukunft für den miRNA-Nachweis und ihre Verwendung als Biomarker. Prof. Zhang schlussfolgert: „Unser Design verbessert die Effizienz von CRISPR-Cas- und RCA-basierten Erkennungsstrategien und zeigt ein großes Potenzial für die laborbasierte Erkennung und Point-of-Care-Tests.“ Da die in dieser Methodik verwendeten Techniken weder unerschwinglich teuer noch komplex in der Durchführung sind, ist die weit verbreitete Übernahme des vorgeschlagenen Ansatzes in klinischen Umgebungen machbar.