Eine neue Möglichkeit, die Aktivität im Inneren einer lebenden Zelle zu sehen

Lebende Zellen werden mit vielen Arten eingehender molekularer Signale bombardiert, die ihr Verhalten beeinflussen. Die Möglichkeit, diese Signale und die Art und Weise, wie Zellen über nachgeschaltete molekulare Signalnetzwerke darauf reagieren, zu messen, könnte Wissenschaftlern dabei helfen, viel mehr über die Funktionsweise von Zellen zu erfahren, einschließlich dessen, was passiert, wenn sie altern oder krank werden.

Derzeit ist eine umfassende Untersuchung dieser Art nicht möglich, da aktuelle Techniken zur Bildgebung von Zellen auf jeweils nur eine Handvoll verschiedener Molekültypen innerhalb einer Zelle beschränkt sind. Allerdings haben MIT-Forscher eine alternative Methode entwickelt, die es ihnen ermöglicht, bis zu sieben verschiedene Moleküle gleichzeitig zu beobachten, möglicherweise sogar mehr.

„Es gibt viele Beispiele in der Biologie, bei denen ein Ereignis eine lange Kaskade von Ereignissen auslöst, die dann eine bestimmte Zellfunktion auslösen“, sagt Edward Boyden, Y. Eva Tan-Professor für Neurotechnologie. „Wie kommt es dazu? Es handelt sich wohl um eines der grundlegenden Probleme der Biologie, und wir fragten uns: Könnte man dem einfach zusehen?“

Der neue Ansatz nutzt grün oder rot fluoreszierende Moleküle, die unterschiedlich schnell an- und ausflackern. Durch die Abbildung einer Zelle über mehrere Sekunden, Minuten oder Stunden und die anschließende Extraktion der einzelnen Fluoreszenzsignale mithilfe eines Rechenalgorithmus kann die Menge jedes Zielproteins verfolgt werden, während sie sich im Laufe der Zeit ändert.

Boyden, der auch Professor für Biotechnik und Gehirn- und Kognitionswissenschaften am MIT ist, Forscher am Howard Hughes Medical Institute und Mitglied des McGovern Institute for Brain Research und des Koch Institute for Integrative Cancer Research des MIT sowie der Co- Direktor des K. Lisa Yang Center for Bionics, ist der leitende Autor der Studie, die in erscheint Zelle. MIT-Postdoc Yong Qian ist der Hauptautor des Papier.

Fluoreszierende Signale

Durch die Markierung von Molekülen in Zellen mit fluoreszierenden Proteinen konnten Forscher viel über die Funktionen vieler Zellmoleküle lernen. Diese Art von Untersuchung wird häufig mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) durchgeführt, das erstmals in den 1990er Jahren für die Bildgebung eingesetzt wurde. Seitdem wurden mehrere fluoreszierende Proteine, die in anderen Farben leuchten, für experimentelle Zwecke entwickelt.

Ein typisches Lichtmikroskop kann jedoch nur zwei oder drei dieser Farben unterscheiden, sodass Forscher nur einen winzigen Einblick in die Gesamtaktivität erhalten, die im Inneren einer Zelle stattfindet. Wenn sie eine größere Anzahl markierter Moleküle verfolgen könnten, könnten Forscher beispielsweise die Reaktion einer Gehirnzelle auf verschiedene Neurotransmitter während des Lernens messen oder die Signale untersuchen, die eine Krebszelle zur Metastasierung veranlassen.

„Idealerweise könnten Sie die Signale in einer Zelle in Echtzeit beobachten, während sie schwanken, und dann könnten Sie verstehen, wie sie miteinander in Beziehung stehen. Das würde Ihnen sagen, wie die Zelle rechnet“, sagt Boyden. „Das Problem ist, dass man nicht sehr viele Dinge gleichzeitig sehen kann.“

Im Jahr 2020 entwickelte Boydens Labor eine Möglichkeit, bis zu fünf verschiedene Moleküle innerhalb einer Zelle gleichzeitig abzubilden, indem leuchtende Reporter auf bestimmte Orte innerhalb der Zelle gerichtet wurden. Dieser als „räumliches Multiplexing“ bekannte Ansatz ermöglicht es Forschern, Signale für verschiedene Moleküle zu unterscheiden, auch wenn sie möglicherweise alle dieselbe Farbe fluoreszieren.

In der neuen Studie verfolgten die Forscher einen anderen Ansatz: Anstatt Signale anhand ihres physischen Standorts zu unterscheiden, erzeugten sie fluoreszierende Signale, die sich im Laufe der Zeit ändern. Die Technik basiert auf „schaltbaren Fluorophoren“ – fluoreszierenden Proteinen, die sich mit einer bestimmten Geschwindigkeit ein- und ausschalten.

Für diese Studie identifizierten Boyden und seine Gruppenmitglieder vier grüne schaltbare Fluorophore und konstruierten dann zwei weitere, die sich alle unterschiedlich schnell ein- und ausschalten. Sie identifizierten außerdem zwei rot fluoreszierende Proteine, die unterschiedlich schnell wechseln, und konstruierten ein zusätzliches rotes Fluorophor.

Jedes dieser schaltbaren Fluorophore kann zur Markierung eines anderen Molekültyps in einer lebenden Zelle verwendet werden, beispielsweise eines Enzyms, eines Signalproteins oder eines Teils des Zellzytoskeletts. Nachdem die Zelle mehrere Minuten, Stunden oder sogar Tage lang abgebildet wurde, verwenden die Forscher einen Rechenalgorithmus, um das spezifische Signal jedes Fluorophors herauszusuchen, analog dazu, wie das menschliche Ohr verschiedene Schallfrequenzen wahrnehmen kann.

„In einem Symphonieorchester gibt es Instrumente mit hohen Tönen, wie die Flöte, und Instrumente mit tiefen Tönen, wie eine Tuba. Und in der Mitte stehen Instrumente wie die Trompete. Sie haben alle unterschiedliche Klänge, und unser Ohr sortiert sie aus.“ „, sagt Boyden.

Die mathematische Technik, die die Forscher zur Analyse der Fluorophorsignale verwendeten, ist als lineare Entmischung bekannt. Diese Methode kann verschiedene Fluorophorsignale extrahieren, ähnlich wie das menschliche Ohr ein mathematisches Modell namens Fourier-Transformation verwendet, um verschiedene Tonhöhen aus einem Musikstück zu extrahieren.

Sobald diese Analyse abgeschlossen ist, können die Forscher sehen, wann und wo jedes der fluoreszenzmarkierten Moleküle während des gesamten Bildgebungszeitraums in der Zelle gefunden wurde. Die Bildgebung selbst kann mit einem einfachen Lichtmikroskop durchgeführt werden, ohne dass eine spezielle Ausrüstung erforderlich ist.

Biologische Phänomene

In dieser Studie demonstrierten die Forscher ihren Ansatz, indem sie sechs verschiedene Moleküle markierten, die am Zellteilungszyklus in Säugetierzellen beteiligt sind. Dies ermöglichte es ihnen, Muster darin zu identifizieren, wie sich die Konzentrationen von Enzymen, die als Cyclin-abhängige Kinasen bezeichnet werden, verändern, während eine Zelle den Zellzyklus durchläuft.

Die Forscher zeigten auch, dass sie andere Arten von Kinasen markieren konnten, die an nahezu jedem Aspekt der Zellsignalisierung beteiligt sind, sowie an Zellstrukturen und Organellen wie dem Zytoskelett und den Mitochondrien. Zusätzlich zu ihren Experimenten mit in einer Laborschale gezüchteten Säugetierzellen zeigten die Forscher, dass diese Technik im Gehirn von Zebrafischlarven funktionieren könnte.

Den Forschern zufolge könnte diese Methode nützlich sein, um zu beobachten, wie Zellen auf jegliche Art von Input reagieren, etwa auf Nährstoffe, Faktoren des Immunsystems, Hormone oder Neurotransmitter. Es könnte auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Zellen auf Veränderungen in der Genexpression oder genetische Mutationen reagieren. Alle diese Faktoren spielen eine wichtige Rolle bei biologischen Phänomenen wie Wachstum, Alterung, Krebs, Neurodegeneration und Gedächtnisbildung.

„Man könnte all diese Phänomene als eine allgemeine Klasse biologischer Probleme betrachten, bei denen ein kurzfristiges Ereignis – wie das Essen eines Nährstoffs, das Lernen von etwas oder eine Infektion – eine langfristige Veränderung hervorruft“, sagt Boyden.

Zusätzlich zu solchen Studien arbeitet Boydens Labor auch daran, das Repertoire an schaltbaren Fluorophoren zu erweitern, damit sie noch mehr Signale innerhalb einer Zelle untersuchen können. Sie hoffen auch, das System so anzupassen, dass es in Mausmodellen verwendet werden kann.

Diese Geschichte wurde mit freundlicher Genehmigung von MIT News erneut veröffentlicht (web.mit.edu/newsoffice/), eine beliebte Website mit Neuigkeiten über MIT-Forschung, Innovation und Lehre.