Die Gattung Populus, allgemein bekannt als Pappeln, Pappeln und Espen, besteht aus etwa 30 Baumarten, die auf der Nordhalbkugel heimisch sind. Aufgrund ihrer vielfältigen Verwendung in der Landschaft, Landwirtschaft, Bioenergie und Industrie standen Populus-Arten im Mittelpunkt zahlreicher Baumzüchtungs- und genetischer Verbesserungsprogramme.
Moderne Biotechnologien, einschließlich Genomik und Gentechnik (GE), gelten als vielseitige Instrumente zur Beschleunigung der Domestizierung von Populus. Darüber hinaus konnten Forscher seit der Veröffentlichung der Genomsequenz von P. trichocarpa im Jahr 2006 und den anschließenden Fortschritten im Next-Generation-Sequencing (NGS) die genetische Grundlage entscheidender Merkmale in Populus erforschen.
Das CRISPR/Cas9-Genomeditierungstool wurde häufig zur Erzeugung von Knockouts im Hybridpappelklon „717-1B4“ (P. tremula x P. alba INRA 717-1B4) eingesetzt. Die Entwicklung alternativer CRISPR-bezogener Tools wie CRISRPa und Base Editing hat gezeigt, dass großes Potenzial zur Verbesserung der Pflanzenfitness besteht. Allerdings bleibt die Anwendung dieser neuen CRISPR-Tools in Populus sehr begrenzt.
Im Mai 2023, Gartenbauforschung veröffentlichte die Forschungsarbeit mit dem Titel „CRISPR/Cas9-basierte Genaktivierung und Basenbearbeitung in Populus„.
Zunächst bauten die Forscher erfolgreich ein Reportergen-basiertes CRISPRa-Bewertungssystem mit hohem Durchsatz in Protoplasten auf. Sie klonierten die Promotoren von OsTRP-ähnlichen oder OsCCR1-Genen, um ein Reporterkonstrukt zu erzeugen.
Durch die Co-Transfektion des OsTRP-ähnlichen Aktivierungsvektors und seines Reportervektors in Arabidopsis-Protoplasten ist das Verhältnis von GUS/LUC sechsmal höher als bei denen ohne Aktivierungsvektor. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für das OsCCR1-Gen erzielt. Sie nutzten dieses Bewertungssystem, um sgRNAs auf Genaktivierung in Populus-Protoplasten zu untersuchen.
TPX2 und LecRLK-G sind entscheidend für das Pflanzenwachstum und die Pflanzenabwehr. Sie klonierten 500 bp große Promotorregionen von TPX2 und LecRLK-G und fügten sie in ein Reporterkonstrukt ein. Sechs bzw. drei sgRNAs wurden für die Gene TPX2 und LecRLK-G ausgewählt. Durch Co-Transfektion der Reporterkonstrukte und des Aktivierungskonstrukts, das jede sgRNA enthält, wurde die Aktivierungseffizienz jeder sgRNA anhand der GUS-Enzymaktivitäten bewertet. Sowohl die sgRNA6 von TPX2 als auch die sgRNA6 von LecRLK-G wurden für weitere stabile Transformationsstudien ausgewählt.
Mithilfe der identifizierten sgRNAs wurden dann stabil transgene Pappeln etabliert. Im Hybridpappelklon „717-1B4“ erhöhte sich die Expression des TPX2-Gens um das 1,5- bis 2,9-fache. In ähnlicher Weise steigerte sich im Klon „WV94“ die Expression des LecRLK-G-Gens bei verschiedenen Ereignissen um das Zweifache und das Siebenfache.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das CRISPR-Act3.0-System in der Lage ist, endogene TPX2- oder LecRLK-G-Gene in stabilen transgenen Pappeln zu aktivieren. Darüber hinaus zielte die Forschung darauf ab, das PLATZ-Protein, das mit krankheitsbezogenen Genen verknüpft ist, durch die Einführung eines vorzeitigen Terminationscodons mithilfe des auf Cas9-Nickase (nCas9) basierenden Cytosin-Base-Editors (CBE) im Pappelklon „717-1B4“ zu kürzen.
Nachdem die Forscher zwei potenzielle Stellen für die Einführung von Stoppcodons identifiziert hatten, testeten sie zwei Baseneditoren (pHEE901(BE3) und A3A/Y130F-BE3) in Pappelprotoplasten. Beide Herausgeber induzierten effektiv C-zu-T-Mutationen im Protoplastensystem. Darüber hinaus zeigte pHEE901(BE3) auch die erwartete Baseneditierung in stabilen transgenen Pappeln.
Zusammenfassend stellt diese Studie eine neuartige Anwendung von CRISPR-Tools, insbesondere CRISPRa und Base Editing, vor, um die Genfunktion in zwei Populus-Arten zu verbessern. Bemerkenswert ist, dass das dCas9-basierte CRISPRa-System Gene in verschiedenen Populus-Genotypen effektiv aktiviert, was potenzielle Auswirkungen auf phänotypische Veränderungen in zukünftigen Untersuchungen hat.
Die Forschung schafft eine wichtige Grundlage für genetische Verbesserungen bei Populus und zeigt das expansive Potenzial von CRISPRa und der Basenbearbeitung bei Gehölzarten auf, was Fortschritte in der Baumzüchtung und anderen Gartenbaupflanzen verspricht.
Mehr Informationen:
Tao Yao et al., CRISPR/Cas9-basierte Genaktivierung und Basenbearbeitung in Populus, Gartenbauforschung (2023). DOI: 10.1093/hr/uhad085